2016屆微生物與生化藥學(xué)學(xué)術(shù)研討

1、2016屆微生物與生化藥學(xué)學(xué)術(shù)研討,一種工程菌的構(gòu)建——以G418為例,,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,G418（Geneticin,遺傳霉素） G418 是慶大霉素生物合成的中間體，也是一種氨基糖苷類抗生素 ,在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。,但作為中間體是含量很少，且其與其他產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，分離提取困難。,G1008

2、,慶大霉素高產(chǎn)菌,有沒有可能敲除其后續(xù)通路，使G418累積？,出發(fā)菌,,目標(biāo)物生物合成通路是否清晰,YES,NO,全基因組測序,,轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變,,構(gòu)建突變子庫,陽性菌株,定位基團(tuán)簇,確定目的基因,確定目的基因的基本流程？,一、查詢其代謝通路——KEGG PATHWAY,目標(biāo)物生物合成通路已知,由圖可知，genQ為我們的目的基因。,情況：若通過育種得到一株產(chǎn)活性產(chǎn)物（產(chǎn)物被鑒定出，但其生物合成途徑尚不完全明確）的菌株,轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插

3、入突變,篩選,陽性菌株,基因測序,定位基團(tuán),回復(fù)突變,產(chǎn)量驗(yàn)證,明確機(jī)制,目標(biāo)物生物合成通路不明確,轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變,轉(zhuǎn)座子（Transposable Element , or transposon）：轉(zhuǎn)座因子或跳躍因子，它可以從遺傳物質(zhì)的一部分跳躍到另一部分，從而引起遺傳變異。,Tn5轉(zhuǎn)座子：核心序列：編碼三個抗生素(新霉素、博萊霉素、鏈霉素)；兩個倒置的IS50：IS50R編碼53KD的Tnp和48KD的轉(zhuǎn)座阻遏蛋白(Inh

4、),兩者使用同一閱讀框，但啟動子不同。IS50L的第1442堿基處存在一個赭石突變(UAA)，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7個堿基不相同，是轉(zhuǎn)座酶(Tnp)的作用位點(diǎn)。,轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（3-12bp）、被稱為靶序列的DNA會被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9

5、個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。,確定目的基因,,代謝通路清晰,,代謝通路部分清晰,,基因測序,一、antiSMAH——尋找基因組上的次級代謝產(chǎn)物基因簇,分為細(xì)菌、真菌和植物，建議輸入郵箱，輸入后應(yīng)該會有郵件提醒，因?yàn)樵诰€比對時(shí)間比較久，網(wǎng)站上說需要幾個小時(shí)的時(shí)間。,,,,如何來定位基因？,然后是數(shù)據(jù)輸入，可以選擇在NCBI上輸入accession號，也可以自己提交數(shù)據(jù)。,,,核心的合成基因,額外的合成基因,運(yùn)輸相關(guān)的

6、基因,調(diào)節(jié)基因,其他基因,和同源基因簇比對的結(jié)果示意圖，還有比對的相似度。,,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,基因表達(dá),確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,注：1.切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種酶，以獲得相同的粘性末端，

7、利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.插入目的基因只是結(jié)構(gòu)基因部分，其表達(dá)需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部位前須有啟動子，后須有終止子,目的基因的獲取,引物設(shè)計(jì),基因組DNA提取,PCR擴(kuò)增,1、傳統(tǒng)CTAB法2、 試劑盒提取3、粗提法,,電泳檢測,,,,,1、引物長度：一般引物長度為18~30堿基；2、 GC含量： 一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一 對引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)；3、退火溫度

8、：45－65 ℃；引物設(shè)計(jì)軟件：Primer系列、 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）,,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：,,電泳檢測：對PCR的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。（例如下面是進(jìn)行VvSUC11基因的電泳結(jié)果）,載體:指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。三種最常用的載體是質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。載體必需具備：

9、①能大量復(fù)制，且對宿主細(xì)胞無害②有多個限制酶切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)最好只有一個③含有復(fù)制起始位點(diǎn)，能夠獨(dú)立復(fù)制④有一定的標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。⑤載體DNA分子大小應(yīng)合適，以便操作。,目的:使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳，使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用。選擇：分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達(dá)載體。組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因+復(fù)制原點(diǎn),,,表達(dá)載體,載體

10、的處理1.限制性酶切產(chǎn)生粘性末端2.去磷酸化減少載體自連3.加入特殊的啟動子，改造成特異表達(dá)載體,4.末端轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生同聚尾，末端補(bǔ)平,限制性核酸內(nèi)切酶：可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。,根據(jù)酶切位點(diǎn)不同，常形成兩種末端結(jié)構(gòu)，即粘性末端和平頭末端,酶切方法的選擇 若用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因形成相同的四個黏性末端，因而可能出現(xiàn)多種連接方

11、式如①質(zhì)粒的自身環(huán)化②目的基因的自身連接③質(zhì)粒與目的基因的連接。因?yàn)橛脝蚊盖袝霈F(xiàn)質(zhì)粒與目的基因的任意連接，所以在實(shí)際操作中多使用雙酶切。,載體與目的基因的連接粘性末端連接,,同一限制酶切位點(diǎn)的連接（單酶切）,不同限制酶切位點(diǎn)的連接（雙酶切）,1.同一限制酶切位點(diǎn)的連接,,重組體,,2.不同限制酶切位點(diǎn)的連接,,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林

12、,基本流程,基因敲除,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,1.基因敲除的原理2.基因敲除的應(yīng)用3.操作流程4.基因敲除的局限性,基因敲除的原理,通常意義上的基因敲除就是指利用同源重組進(jìn)行的基因敲除適用范圍：適用的細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞;原理(應(yīng)用DNA同源重組原理)：通過外源載體和內(nèi)源靶點(diǎn)相同的核苷酸序列之間的重組,使

13、外源DNA整合到靶細(xì)胞的特定的基因座上,www.themegallery.com,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,單交換,雙交換,圖1,圖2,同 源 重 組 原 理 圖 示,,,,,,,,,質(zhì)粒,細(xì)菌基因組：,同源臂,待敲除基因,基因敲除的應(yīng)用,1、建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；2、改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)；目前人類基因組研究多由新基因序列的篩選檢測

14、入手，進(jìn)而用基因敲除法在小鼠上觀察該基因的缺失引起的表型變化3、治療遺傳病，即基因治療；4、改造生物、培育新的生物品種—途徑工程中的應(yīng)用。,例：1989年囊性纖維化?。–F）的致病基因（CFTR）被成功地克隆； 1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，為CF基因治療提供了很好的動物模型，得以順利通過基因治療的動物實(shí)驗(yàn)；1993年開始臨床實(shí)驗(yàn)并獲得成功。,操作流程,待敲除基因的確定同源臂的獲取同源臂的連

15、接載體選擇及與外源DNA的連接轉(zhuǎn)化和篩選,同源臂的獲取,PCR擴(kuò)增：,引物（酶切位點(diǎn)）模板：含目的基因細(xì)菌的全基因組DNA酶：Taq DNA聚合酶,同源臂的連接,Overlap PCR(重疊延伸PCR)：,載體選擇,穿梭質(zhì)粒：具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記,氨芐青霉素抗性基因紅霉素抗性基因（erm）耐熱的β-半乳糖糖苷酶基因（bgaB）,大腸桿菌-葡萄球菌穿梭質(zhì)粒pMAD：,載體與外源DNA的連接,轉(zhuǎn)化和篩選,

16、基因敲除的局限性,隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T可以提供同樣的功能；對于某些必需基因，敲除后會造成細(xì)胞的致死性，也就無法對這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究了。,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的

17、基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞非轉(zhuǎn)化子：未接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子非重組子：僅含有空載載體分子的轉(zhuǎn)化子期望重組子：含有目的基因的重組子非期

18、望重組子：不含目的基因的重組子,DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，基因工程接下來的工作就是將目的基因?qū)胩囟ǖ氖荏w細(xì)胞，使之大量繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀。,轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。,導(dǎo)入方法：1.Ca2+誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化2.電穿孔轉(zhuǎn)化3.三親本雜交結(jié)合轉(zhuǎn)化,重組體克隆的篩選與鑒定,在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、或轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中，由于重組率和轉(zhuǎn)化

19、率不可能達(dá)到100%的理想極限，所以我們需要從大量的細(xì)胞中篩選出我們所期待的克隆子。,由于受體細(xì)胞的種類、載體類型、DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法等的不同，重組體的篩選與鑒定方法也不相同。,載體遺傳標(biāo)記篩選法原理：利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化子或重組子進(jìn)行初步篩選1.抗藥性篩選2.插入失活篩選3.插入表達(dá)篩選4.顯色互補(bǔ)篩選,,依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法1.快速裂解菌落鑒定分子大小2.限制

20、性內(nèi)切酶核酸分析法3.利用PCR方法篩選重組子,選擇生長狀態(tài)好及生物效價(jià)高的一株，提取其基因組DNA，采用引物P5/P6進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，與理論大小 561 bp 一致，經(jīng) DNA 測序，結(jié)果準(zhǔn)確，最終得到了目標(biāo)菌株，即 gen Q*基因缺失工程菌。,1:GQ175/(P7/P8); 2: GQ1/(P7/P8); 3: G1008/(P7/P8); 4: GQ1/(P5/P6).,核酸分子雜交檢測法 基本原理：具有

21、一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等的條件下，可按堿基互補(bǔ)配對的原則高度特異地復(fù)性成雙鏈。雜交雙方是待測的核酸序列和用于檢測的已知片段。核酸分子雜交的檢測法可分為Southern印記雜交、Northern印記雜交、菌落印記原位雜交、斑點(diǎn)印記雜交。,免疫化學(xué)檢測法使用抗體探針，而非DNA探針來鑒定目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。1.放射性抗體測定法2.非放射性抗體測定法3.免疫沉淀法,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作圖

22、 如果DNA片段中的目的基因能夠轉(zhuǎn)錄生成mRNA產(chǎn)物，通過對mRNA的分析，也可以間接鑒定重組DNA分子，對目的基因進(jìn)行定位研究?；虮磉_(dá)產(chǎn)物分析法 如果重組質(zhì)粒的目的基因能順利表達(dá)，那么只要能檢測到該目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，就能說明該重組質(zhì)粒含有目的基因。,DAN序列測定法 DNA序列測定，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，簡稱DNA測序。對克隆DNA片段進(jìn)行序列測定及分析，不僅可以直觀地鑒定出重組DNA分子

23、中是否含有目的基因，也可以獲得目的基因的編碼序列和調(diào)控序列，這對目的基因的表達(dá)及其功能研究具有重要意義。,,,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,產(chǎn)物分析,1、表達(dá)體系2、基因表達(dá)過程3、代謝產(chǎn)物分析,確定目的基因,,基因敲除,,基因表達(dá),,目的基因的導(dǎo)入、檢測與篩選,,產(chǎn)物分析,傅慧垚,劉亞洲,張君利,鐘艾玲,郭森林,基本流程,1、表達(dá)體

24、系 基因重組和克隆的最終目標(biāo)通常是使克隆基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，以便獲得表達(dá)產(chǎn)物從而為人們所利用。 當(dāng)前各種先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)方法已成功實(shí)現(xiàn)外源基因在動物、植物和酵母等真核宿主細(xì)胞，以及原核細(xì)胞中高效表達(dá)。,1、表達(dá)體系原核表達(dá)體系優(yōu)點(diǎn)：①無核膜，染色體是裸露的環(huán)形DNA，轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)連續(xù)進(jìn)行；②表達(dá)以操縱子為單位，是數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)構(gòu)成一個基因表達(dá)的協(xié)同單位；③一般無內(nèi)含子

25、，缺乏轉(zhuǎn)錄后加工過程；④只有一種RNA聚合酶識別原核細(xì)胞的啟動子，基因表達(dá)控制主要在轉(zhuǎn)錄水平；真核有三種RNA聚合酶；⑤mRNA上有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，有SD序列，真核缺乏。,2、基因表達(dá)過程,2.1 轉(zhuǎn)錄 起始（initiation）:識別啟動子，形成“泡”，以及mRNA合成開始 延伸（elongation）:“泡”沿著DNA遷移 終止（termination）:此時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄物釋放，“泡”關(guān)閉,轉(zhuǎn)錄終止子：（

26、作用機(jī)制不同） ①一類在ρ因子的作用下使mRNA的轉(zhuǎn)錄終止； ②另一類根據(jù)DNA模版中的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而使新生的mRNA終止轉(zhuǎn)錄。,2.2 翻譯,原核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯是重疊進(jìn)行的，在轉(zhuǎn)錄未完成時(shí)翻譯已經(jīng)開始。,1.翻譯起始復(fù)合物的形成2.細(xì)菌中肽鏈延伸的第一步反應(yīng)：第二個氨酰-tRNA的結(jié)合,3.細(xì)菌中肽鏈延伸的第二步反應(yīng)：肽鏈的生成4.細(xì)菌中肽鏈延伸的第三步反應(yīng)：移位,肽鏈的終止釋放因

27、子（release factor,RF）：識別終止密碼子并與之結(jié)合 Ⅰ類釋放因子 識別終止密碼子，并能催化新合成的多肽從P位點(diǎn)的tRNA中水解釋放出來。（細(xì)菌：RF1、RF2） Ⅱ類釋放因子 在多肽鏈釋放后刺激Ⅰ類釋放因子從核糖體中解離出來。（細(xì)菌：RF3）,2.3 基因表達(dá)調(diào)控元件,1 啟動子元件 Pribnow型啟動子：主要類型，-10區(qū)（TATAAT）也叫Pribnow框、-35區(qū)（TTGACA）也叫Sexta

28、ma框兩個相距17bp的保守區(qū)和 間隔區(qū)，能夠被含有σ70因子的RNA聚合酶所識別。 Ntr型啟動子：-12區(qū)、-24區(qū)，間隔區(qū)。能夠被含有σ54因子的RNA聚合酶所識別。2 增強(qiáng)子 增加啟動子轉(zhuǎn)錄效率，用于構(gòu)建新型高效表達(dá)載體，提高克隆基因在元和表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率。hylR增強(qiáng)子---作用原理，直接或間接導(dǎo)致DNA彎曲，以使調(diào)節(jié)蛋白更接近轉(zhuǎn)錄起始部位。（細(xì)菌溶血素基因質(zhì)粒啟動子phyⅠ，50倍）,3 終

29、止子 本征終止子：不需要其他蛋白輔助。發(fā)夾結(jié)構(gòu)和緊隨其后的6個連續(xù)的U串。 依賴性終止子：ρ因子。4 衰減子 利用原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)特性，依賴自身巧妙的特征序列和相應(yīng)的RNA二級結(jié)構(gòu)，對基因進(jìn)行開關(guān)式微調(diào)作用，保證原核生物相關(guān)操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個基底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。 最先發(fā)現(xiàn)于，大腸埃細(xì)菌色氨酸操縱子，位于操縱基因與第一個結(jié)構(gòu)基因trpE之間。在trpEmRNA的前導(dǎo)序列

30、中有一個編碼14個氨基酸殘基的開放閱讀框，其上游是核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列，下游是一個典型的本征終止子結(jié)構(gòu)，有28個堿基組成。前導(dǎo)序列、終止子以及相關(guān)的間隔序列共同共同構(gòu)成了衰減子。,3、代謝產(chǎn)物分析3.1 工程菌GQ175經(jīng)斜面培養(yǎng)3代，其形態(tài)特征沒有發(fā)生明顯變化，生長良好，產(chǎn)孢豐富，說明其遺傳性狀穩(wěn)定。 對 GQ175 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并以親株G1008 作對照，發(fā)酵完成后，對 GQ175 和 G1008兩者發(fā)酵液進(jìn)

31、行預(yù)處理， 檢測生物效價(jià)。 結(jié)果顯示，GQ175 的生物效價(jià)為 828 mg/L，與親株 G1008 的930 mg/L 相當(dāng)，說明其產(chǎn)抗能力沒有因?yàn)?genQ*缺失而受到影響。,3.2 將預(yù)處理的發(fā)酵液經(jīng) 732 氨型樹脂吸附，洗脫后再用乙醇沉淀，得到粗制樣品。,3.3 粗制樣品通過TLC 和 MS 檢測， GQ175 的代謝產(chǎn)物與親株 G1008進(jìn)行比較，分析基因 genQ*缺失對慶大霉素代謝流的影響。 TLC 檢測結(jié)果

32、如圖 5 所示:,1、 GQ175 不再合成慶大霉素C族組分，只產(chǎn)生了一種與 G418 標(biāo)準(zhǔn)品遷移率一樣的物質(zhì)，初步判定為 G418。2、 經(jīng)MS進(jìn)一步分析， G1008 代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖有 3 個主峰：分子量為 450.3 (C1a)、464.3 (C2、C2a、C2b)和 478.3(C1)，而 497.3 (G418)分子強(qiáng)度峰極低；而 GQ175代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖主峰為 497.3，與 G418 的分子量吻合， 322.2

33、 的峰為碎片峰， 249.1 的為雙電荷峰。 因此，阻斷突變株 GQ175 不再合成慶大霉素 C 族組分，只合成 G418 單一組分。,總結(jié),1. 通過破壞絳紅小單孢菌 G1008 中g(shù)enQ*的功能，構(gòu)建 G418 單組工程菌。2. 為了盡量避免對菌株的損傷以及影響 genQ*上下游基因的表達(dá)，選擇敲除 genQ* 1/3 (621 bp)的中間序列，得到一 株 G418 單 組 分 工 程 菌 M. purpurea G

34、Q175(CGMCC No. 8543)，不積累慶大霉素 X2 及其他慶大霉素組分。3.生物效價(jià)測定， GQ175 的發(fā)酵單位為828 mg/L，與親株 G1008 的 930mg/L 相當(dāng)，說明工程菌保持了親株的產(chǎn)抗能力。,總結(jié),4. 然而 G418 的抑菌效率比 C 族復(fù)合物低得多，因此工程菌產(chǎn) G418 的物質(zhì)量已經(jīng)超過了親株產(chǎn) C 族復(fù)合物的物質(zhì)量?？赡苁怯捎趹c大霉素生物合成中左支路物質(zhì)流量也流向了 G418 的合成，或者慶