論文答辯模板

1、動(dòng)物科技學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文答辯,布魯氏菌019株弱化與基因缺失株構(gòu)建及初步免疫評(píng)價(jià),姓 名：指導(dǎo)老師：,研究背景,研究目的,試驗(yàn)研究,全文結(jié)論,1,2,3,4,匯報(bào)內(nèi)容,論文創(chuàng)新,5,文章發(fā)表,6,,一、研究背景,布魯氏菌病 (Brucellosis) 是一種人畜共患傳染病，在全世界范圍內(nèi)廣泛分布，在我國也有大量的動(dòng)物發(fā)生感染，新疆是我國的高發(fā)地區(qū)。 動(dòng)物感染布魯氏菌后主要表現(xiàn)為波浪熱，關(guān)節(jié)腫大及生殖系統(tǒng)的疾病。,,

2、,目前布魯氏菌病的預(yù)防控制主要通過疫苗接種，我國主要采用弱毒活疫苗有M5-90、S2等。 疫苗株的缺陷：毒力仍然較強(qiáng)；存在返強(qiáng)的潛在威脅；不能有效區(qū)分疫苗免疫和自然感染。,一、研究背景,pgm基因編碼的磷酸葡萄糖變位酶，參與布魯氏菌脂多糖O鏈裝配過程，該基因的缺失會(huì)影響光滑型布魯氏菌LPS的合成。 由于LPS是介導(dǎo)宿主先天性免疫反應(yīng)的重要抗原，pgm基因是布魯氏菌重要的毒力基因。,一、研究背景,目前，國內(nèi)外已有布

3、魯氏菌pgm基因突變或缺失的報(bào)道： Juan等將布魯氏菌S19進(jìn)行了pgm基因敲除，獲得了布魯氏菌pgm基因缺失株，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明：pgm基因缺失株不能合成LPS，同時(shí)也檢測(cè)不到O鏈抗體，和親本株S19有相似的免疫保護(hù)性。,一、研究背景,,,布魯氏菌019株是1980年在新疆紫泥泉種羊場(chǎng)被發(fā)現(xiàn)并分離；較其他野毒株，毒力較弱，但依然可誘發(fā)動(dòng)物的病理損傷，主要引起公羊的附睪炎等癥狀。 布魯氏菌氫氧化鋁佐劑滅活苗接種羊群后

4、，保護(hù)率可達(dá)75%。,一、研究背景,通過物理和化學(xué)的方法對(duì)布魯氏菌019株進(jìn)行誘導(dǎo)突變，分析生長狀況及毒力的變化。 針對(duì)布魯氏菌磷酸葡萄糖變位酶基因（pgm）定向構(gòu)建布魯氏菌019的pgm基因缺失株，并對(duì)其毒力及免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；探討布魯氏菌019株致弱后作為疫苗株的潛力。,二、研究目的,,,三、實(shí)驗(yàn)研究,,布魯氏菌019株弱化與毒力評(píng)價(jià),,,,實(shí)驗(yàn)二,布魯氏菌019Δpgm基因缺失株構(gòu)建,,,,實(shí)驗(yàn)三,布魯氏菌019Δpgm

5、毒力及初步免疫評(píng)價(jià),,實(shí)驗(yàn)一 布魯氏菌019株弱化與毒力評(píng)價(jià),0.1%、0.05%吖啶橙,實(shí)驗(yàn)方案,連續(xù)轉(zhuǎn)接50次,0.1%、0.05%苯酚,紫外線照射5min、2min,,生長曲線,小鼠脾臟指數(shù),脾臟CFU計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)毒力變化,布魯氏菌019株,,,自身生長能力,疫苗應(yīng)用前景評(píng)價(jià),,,,結(jié)果與分析,,1、生長曲線的繪制,結(jié)果顯示：25 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，細(xì)菌隨時(shí)間變化快速增長，61 h后菌數(shù)趨于穩(wěn)定。,2、代時(shí)比較,,結(jié)果顯示：

6、各處理組細(xì)菌代時(shí)與親本019株相比較均有不同程度的增加。,結(jié)果與分析,3、小鼠脾臟指數(shù)變化,,,結(jié)果顯示：1?108菌/只腹腔接種小鼠后，苯酚處理組和紫外照射處理組小鼠脾指數(shù)明顯低于親本株019株（P0.05）。,結(jié)果與分析,,,4 、小鼠脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù),結(jié)果顯示： 各處理組布魯氏菌在小鼠脾臟內(nèi)的細(xì)菌均有不同程度的減少，但均顯著高于疫苗株M5-90組。經(jīng)0.1g/L吖啶橙處理和5min紫外線處理組小鼠脾臟CFU與親本株019相比明顯減少，

7、差異顯著（P<0.05）。,結(jié)果與分析,對(duì)布魯氏菌019株進(jìn)行紫外照射或吖啶橙、苯酚誘導(dǎo)處理后，毒力發(fā)生了一定變化。 各處理組生長特性也發(fā)生了不同程度的變異，說明短暫的誘導(dǎo)不僅可以影響其毒力的變化也影響了其自身生存能力。,討論,,,實(shí)驗(yàn)二 布魯氏菌019Δpgm基因缺失株構(gòu)建,根據(jù)GeneBank上發(fā)表的綿羊附睪布魯氏菌019基因組序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增pgm基因的上下游同源臂,上下游同源臂融合后連接T載體，測(cè)序正確后

8、與pGEM-7zf+載體連接,,基因突變株傳代10代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定,根據(jù)發(fā)表的枯草芽孢桿菌SacB基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因,,,自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至布魯氏菌019株中，分別經(jīng)過Amp抗性篩選和蔗糖敏感性篩選，獲得同源重組交換子,構(gòu)建布魯氏菌同源重組自殺質(zhì)粒pGEM-7zf+Δpgm-sacB,SacB基因與T載體連接，測(cè)序,,,,實(shí)驗(yàn)方案,,,結(jié)果與分析,pgm-N基因的PCR 擴(kuò)增圖,pgm-C基因的PCR 擴(kuò)增圖,1、PCR擴(kuò)增p

9、gm基因上下游同源臂,,,結(jié)果與分析,PMD19-T--Δpgm質(zhì)粒酶切鑒定圖,pgm-N-C融合片段,2、PMD19T-Δpgm質(zhì)粒構(gòu)建,,,結(jié)果與分析,pGEM-Δpgm-SacB質(zhì)粒酶切鑒定圖,SacB基因的PCR 擴(kuò)增圖,3、pGEM-7zf+Δpgm-SacB質(zhì)粒構(gòu)建,結(jié)果與分析,019 Δpgm傳代圖,4、缺失株019Δpgm的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè),驗(yàn)證結(jié)果表明：019 Δpgm具有良好的遺傳穩(wěn)定性,,,1.同源重組機(jī)制的分析

10、 本實(shí)驗(yàn)結(jié)論：同源重組是整個(gè)環(huán)形質(zhì)粒先線性化后插入布魯氏菌的染色體上，再進(jìn)一步地進(jìn)行基因置換。 2. 影響同源重組效率的因素 基因敲除過程中，電轉(zhuǎn)化是將外源基因?qū)氲桨屑?xì)胞內(nèi)最常用的手段之一，受各方面的影響：如電壓、電擊時(shí)間、電擊杯厚度、質(zhì)粒濃度、感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)量。 只有當(dāng)這些條件均合適時(shí)才能達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化效率，快速獲得基因缺失株。,討論,,,實(shí)驗(yàn)三 布魯氏菌019Δpgm毒力變化

11、及初步免疫評(píng)價(jià),小鼠實(shí)驗(yàn),,ELISA檢測(cè)血清中IgG的含量,,ELISA檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ含量,實(shí)驗(yàn)方案,M5-90、S2、019和019Δpgm,脾臟指數(shù),脾臟CFU計(jì)數(shù),,019、019Δpgm滅活佐劑的制備,,,毒力評(píng)價(jià),,免疫效果評(píng)價(jià),,,,,結(jié)果與分析,,1、小鼠脾臟指數(shù),結(jié)果顯示：布魯氏菌019?pgm與019無明顯（P>0.05），但顯著性高于布魯氏菌M5-90和S2組（P<0.05）。,,,結(jié)果與分析

12、,2、感染后小鼠脾臟CFU計(jì)數(shù),,結(jié)果顯示：019?pgm與親本株019無明顯差異（P>0.05），顯著性高于布魯氏菌M5-90和S2組（P<0.05）,,,結(jié)果與分析,3、體液免疫水平檢測(cè)-IgG,019?pgm滅活全菌佐劑制劑與親本株019滅活全菌佐劑制劑相比其IgG含量差異不顯著（P>0.05），隨之時(shí)間的延長，抗體水平呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)趨勢(shì)，但是，均顯著性低于疫苗株M5-90（P<0.05）。,,結(jié)果與分析

13、,4、細(xì)胞免疫水平檢測(cè)—IFN- γ,30天內(nèi)019?pgm和019滅活全菌佐劑制劑相比，其IFN-γ含量差異不顯著（P>0.05），但均低于疫苗株M5-90（P<0.05）；在第30天，019?pgm活全菌佐劑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ含量最低，顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組。,,,討論,1、 感染小鼠后毒力評(píng)價(jià) 019Δpgm相較與親本019株感染小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 019Δpgm毒力沒有發(fā)生明顯下降，可能是由

14、于pgm基因并非布魯氏菌的主效毒力因子，或該基因在布魯氏菌內(nèi)還有其他功能相近的基因共同發(fā)揮作用。,討論,,2、體液免疫水平分析 019?pgm組與親本株019組小鼠在感染初期第10天即可產(chǎn)生較高水平的 IgG，并在第20天后達(dá)到最高水平。 同時(shí)本研究中使用的完全弗氏佐劑，可以使抗原在體內(nèi)緩慢釋放，延長與免疫細(xì)胞作用時(shí)間，并可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。,討論,,,3、

15、細(xì)胞免疫水平分析 IFN-γ是強(qiáng)有力的巨噬細(xì)胞活化因子，對(duì)于殺死胞內(nèi)的布魯氏菌發(fā)揮巨大的作用。 細(xì)胞因子IFN-γ檢測(cè)結(jié)果表明，M5-90在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的能力強(qiáng)于019Δpgm和019全菌佐劑制劑，說明滅活疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面仍然存在不足。,討論,1. 經(jīng)紫外照射5min處理可有效降低布魯氏菌019毒力。2. 構(gòu)建并篩選了019Δpgm缺失株，10代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)突變；其毒力與

16、親本株無明顯差異。3. 制備布魯氏菌019Δpgm滅活全菌佐劑制劑，初步免疫評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：其可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的體液免疫和細(xì)胞免疫水平，但均低于M5-90弱毒苗。,四. 全文結(jié)論,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了布魯氏菌019株pgm基因缺失株，并檢測(cè)了其毒力；并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。,五. 論文創(chuàng)新,六. 文章發(fā)表,文章發(fā)表,六. 文章發(fā)表情況,李亞, 陳創(chuàng)夫, 張輝, 等. 流產(chǎn)布魯氏菌2308株磷酸甘露糖變位酶pmm基因缺失株構(gòu)建及鑒定.西