假微型海鏈藻dgat基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　假微型海鏈藻DGAT基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、;p>　　背景：隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速增長，石油、煤炭和天然氣等化石能源的消耗大幅度上升，導(dǎo)致一方面化石能源日益枯竭，另一方面，大量的二氧化碳?xì)怏w進(jìn)入大氣，引起溫室效應(yīng)。自《京都議定書》簽署生效后，二氧化碳在全球范圍內(nèi)受到排放限制，如何減排二氧化碳并對其進(jìn)行資源化利用也成為研究熱點(diǎn)。在各種可再生能源中，具有廣泛實(shí)用價(jià)值的能源是生物質(zhì)能。生物質(zhì)是地球上最普遍的一種可再生能源資源，它包括林業(yè)生物質(zhì)、能源作物、水生植物、農(nóng)業(yè)廢棄物、城市垃圾

3、、有機(jī)廢水和人畜糞便等。在生物質(zhì)的循環(huán)利用中，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的碳與植物生長所吸收的碳的量幾乎相等。因此生物質(zhì)的利用不會造成大氣中二氧化碳的增加。生物質(zhì)燃料中硫含量極少，不會排放導(dǎo)致酸雨的二氧化硫；而且生物質(zhì)燃燒產(chǎn)生的灰分較少，這些灰分還可用作農(nóng)作物肥料。近年來生物柴油(Biodiesel)作為化石能源的替代燃料，已成為國際上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的環(huán)?？稍偕茉?。</p><p>　　意義：微藻是一類在水中生長的種類

4、繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞工廠，通過微藻細(xì)胞高效的光合作用，吸收CO2，將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等化合物的化學(xué)能，并放出O2。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生長最為迅速的一種低等植物，而且某些微藻可以生長在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進(jìn)行培養(yǎng)，還可以利用工業(yè)廢氣中的CO2，是制備生物柴油的良好原料，是未來生物柴油發(fā)展的研究熱

5、點(diǎn)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　研究的基本內(nèi)容：1.構(gòu)建含DGAT基因的重組質(zhì)粒以適用于擬南芥中的表達(dá)。2.含GFP熒光蛋白的DGAT重組質(zhì)粒的構(gòu)建。</p><p>　　擬解決的主要問題：1.克隆基因的酶切位點(diǎn)問題、載體酶切的問題、連接片段濃度比的問題 2.采用In-Fusion基因克隆法重組質(zhì)粒時(shí)出現(xiàn)低轉(zhuǎn)化率

6、、DNA片段低質(zhì)量、對照組重組克隆良好而實(shí)驗(yàn)組克隆效率低、大多數(shù)克隆子不含DGAT目的基因、大多數(shù)克隆子含有非目的基因的片段。</p><p>　　研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　研究方法：1.對pCAMBIA1300表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切得到線性質(zhì)粒。采用In-Fusion基因克隆法，根據(jù)線性表達(dá)質(zhì)粒的末端15個(gè)堿基和DGAT全長基因設(shè)計(jì)合適的引物來進(jìn)行PCR。對擴(kuò)增得到DGAT

7、基因進(jìn)行合適的酶切，然后用In-Fusion酶處理DGAT基因片段和pCAMBIA1300線性質(zhì)粒，得到含DGAT基因的pCAMBIA1300-DGAT重組質(zhì)粒。</p><p>　　2.用雙酶切法酶切含GFP基因的pAcGFP1-1質(zhì)粒，得到具有粘性末端的GFP基因片段。同樣酶切處理含有DGAT基因全長序列的pMD18-T測序質(zhì)粒，得到具有粘性末端的DGAT基因。用連接酶處理兩個(gè)片段得到GFP-DGAT線性片段

8、。同樣采用In-Fusion基因克隆法，對pCAMBIA1300表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切得到的線性質(zhì)粒。然后根據(jù)GFP-DGAT線性片段和線性表達(dá)質(zhì)粒的末端15個(gè)堿基設(shè)計(jì)合適的引物，PCR擴(kuò)增GFP-DGAT片段，得到的片段與線性表達(dá)質(zhì)粒用In-Fusion酶處理，得到pCAMBIA1300-GFP-DGAT重組質(zhì)粒。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)1技術(shù)路線：</b></p>&

9、lt;p><b>　　實(shí)驗(yàn)2技術(shù)路線：</b></p><p>　　研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.11 指導(dǎo)老師畢業(yè)論文題目下達(dá)</p><p>　　2010.11-2010.12 進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，完成開題報(bào)告及任務(wù)書，制定具體研究計(jì)劃和實(shí)驗(yàn)方案。</p><p>

10、　　2011.2-2011.3 完成2篇外文翻譯</p><p>　　2011.3-2011.4 假微型海鏈藻DGAT基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)階段及結(jié)果的觀察記錄與分析</p><p>　　2011.4-2011.5 論文撰寫、提交并答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><

11、p>　　[1] Brown C, Knights B A. Hydrocarbon content and it’s relationship to physiological state in the Green Alga Botryococcus braunii. Phytochemistry, 1969, 8(3):543-547</p><p>　　[2] Largeau C, Casadevall

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14、n in transgenic plants[J]. Plant Cell,1996,8:281-292.</p><p>　　[6] SAHA S，ENUGUTTI B，RAJAKUMARI S，RAJASEKHARAN R．Cytosolic triacylglycerol biosynthetic pathway in oilseeds．Molecularcloning and expression of

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28、 J Biol Chem, 2006, 281(52): 40273?40282.</p><p>　　[20]Fries R, Winter A .Method of testing a mammal for its predisposition for fat content of milk and/or its predisposition for meat marbling. Patent , Inter

29、national Application Number: PCT/EP 02/07520,2002,World International Property Organization.</p><p>　　[21] Womack J E, Johnson J S, Owens E K, Rexroad C E, Schlapfer J, Yang Y P, A whole-genome radiation hyb

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32、az I, Sanchez A. A QTL on pig chromosome 4 affects fatty acid metabolism:evidence from an Iberian by Landrace intercross. J Anim Sci,2000,78(10):2525~2531.</p><p>　　[24]De Koning D J, Janss L L, Rattink A P,

33、 van Oers P A, de Vries B J, Groenen M A, van der Poel J J, de Groot P N, Brascamp E W, van Arenndonk J A.Detection of quantitative trait loci for backfat thickness and intramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genet

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37、omposition by an ethyl methanesulfonate-induced mutation in Arabidomis thaliana affecting diacylglycerol acyltransferase activity[J]．Plant Physiology，1995，108(1)：399—409．</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b>

38、</p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　DGAT基因的研究現(xiàn)狀</p><p>　　摘要：能源是國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要基礎(chǔ)。隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速增長，石油和煤炭等化石能源日益枯竭，能源短缺制約了社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。能源、環(huán)境和社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的矛盾日益突出。藻類具有生物量大、生長周期短、易培養(yǎng)以及含有較高的脂類等特點(diǎn)，是制備生物質(zhì)

39、液體燃料的良好材料。</p><p>　　關(guān)鍵詞：假微型海鏈藻；尼羅紅；乙酰輔酶A羧化酶；二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶；擬南芥</p><p><b>　　正文： </b></p><p><b>　　1．生物能源的現(xiàn)狀</b></p><p>　　隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速增長，石油、煤炭和天然氣等化石能源的消耗

40、大幅度上升，導(dǎo)致一方面化石能源日益枯竭，另一方面，大量的二氧化碳?xì)怏w進(jìn)入大氣，引起溫室效應(yīng)。自《京都議定書》簽署生效后，二氧化碳在全球范圍內(nèi)受到排放限制，如何減排二氧化碳并對其進(jìn)行資源化利用也成為研究熱點(diǎn)。在各種可再生能源中，具有廣泛實(shí)用價(jià)值的能源是生物質(zhì)能。生物質(zhì)是地球上最普遍的一種可再生能源資源，它包括林業(yè)生物質(zhì)、能源作物、水生植物、農(nóng)業(yè)廢棄物、城市垃圾、有機(jī)廢水和人畜糞便等。在生物質(zhì)的循環(huán)利用中，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的碳與植物生長所吸收

41、的碳的量幾乎相等。因此生物質(zhì)的利用不會造成大氣中二氧化碳的增加。生物質(zhì)燃料中硫含量極少，不會排放導(dǎo)致酸雨的二氧化硫；而且生物質(zhì)燃燒產(chǎn)生的灰分較少，這些灰分還可用作農(nóng)作物肥料。近年來生物柴油(Biodiesel)作為化石能源的替代燃料，已成為國際上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的環(huán)?？稍偕茉?。</p><p><b>　　2．微藻的優(yōu)點(diǎn)</b></p><p>　　微藻是一類在水

42、中生長的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞工廠，通過微藻細(xì)胞高效的光合作用，吸收CO2，將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等化合物的化學(xué)能，并放出O2。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生長最為迅速的一種低等植物，而且某些微藻可以生長在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進(jìn)行培養(yǎng)，還可以利用工業(yè)廢氣中的CO2。因此，微藻生物柴油成為了潛在的能源研究熱

43、點(diǎn)。目前的產(chǎn)油藻主要是葡萄藻（Botryococcus braunii）[1,2]、小球藻（Chlorella pyrenoidosa）[3,4]等。</p><p>　　3．二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGAT的研究現(xiàn)狀</p><p>　　二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是一種甘油酰基轉(zhuǎn)移酶，該酶與脂肪代謝、脂類在組織中的沉積有很大

44、的關(guān)系，它的主要作用機(jī)制是使二酰甘油（diacylgycerol,DAG）加上脂肪酸酰基形成三酰甘油（triacylgycerol,TAG）。在植物中，TAG的合成對種子油脂的形成十分重要[5]。</p><p>　　到目前為止，在植物中共發(fā)現(xiàn)3類DGAT基因家族，包括DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族[6,7]。DGAT3基因家族是Saha等[6]從發(fā)育中的花生子葉細(xì)胞質(zhì)中克隆的一個(gè)與TAG合成相關(guān)的基

45、因，該基因?qū)儆贒GAT基因家族，但是與DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10%，因此將其稱為DGAT3基因。</p><p>　　DGAT1基因家族只存在于動(dòng)物和植物中[8~11]。高等植物DGAT1蛋白的氨基酸殘基數(shù)一般在480～550之間，不同物種的DGAT氨基端前100個(gè)氨基酸殘基相似性較低(低于20%)，而位于100以后的氨基酸殘基相似性較高(大于70%)，可能正是這種N端的差異導(dǎo)致不同植物DGA

46、T1酶屬性的不同[12]。DGAT2基因家族的成員在動(dòng)物、植物和酵母中都存在[8,12,13,14]，并且與DGAT1基因家族沒有明顯的相關(guān)性。DGAT2 酶是機(jī)體內(nèi)一種非常重要的酶, 它被認(rèn)為是控制高甘油三酯(TAG)所致疾病, 如肥胖癥、高血糖、糖尿病、冠病、脂質(zhì)代謝紊亂、脂肪肝、高甘油三酯血癥等代謝異常綜合征等的潛在標(biāo)靶[15~19]。對于植物DGAT2的研究較少，目前已知的植物DGAT2蛋白氨基酸殘基數(shù)在320左右。DGAT3基

47、因目前只在花生中發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列與上面兩種DGAT家族同源性很低，但是具有類似DGAT蛋白功能基序[6]。</p><p>　　DGAT相關(guān)基因可能對肌內(nèi)脂肪含量產(chǎn)生重要影響，從而影響肉質(zhì)，該基因極有希望成為影響肉質(zhì)性狀肌內(nèi)脂肪含量候選基因。證據(jù)如下:（1）DGAT酶直接參與三酰甘油的合成[8]；（2）EST分析證明，DGAT1基因不僅在牛乳腺中表達(dá)，而且在牛脂肪組織中表達(dá)[20]；（3）放射雜交定位法將DGAT

48、基因定位于牛14號染色體19CM處，與CSSM66緊密連鎖[21,22]，而影響牛肌內(nèi)脂肪含量的QTL區(qū)間內(nèi)正好存在該基因;（4）豬DGAT1基因定位于SSC4p15，在這一區(qū)域內(nèi)存在可能影響豬生長速度、肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成的QTL[23~25]。在NCBI中已有豬DGAT1基因cDNA及DNA全長和遺傳位置，但其物理位置如何還需進(jìn)一步確定，豬DGAT2基因的研究仍是空白。迄今為止，國內(nèi)外尚未開展雞、鴨、鵝等禽類DGAT相關(guān)基因的研

49、究。</p><p>　　研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥Tag1基因插入突變體AS11中，種子DGAT1活性降低，同時(shí)三酰甘油含量降低；脂肪酸組成發(fā)生變化，其中花生酸(20：1)、油酸(18：1)含量降低，而亞麻酸(18：3)作為三酰甘油的主要脂肪酸大量積累，亞油酸變化不大；種子發(fā)育遲緩，而且平均重量降低[26,27]。通過構(gòu)建野生型AtDGAT1基因cDNA單拷貝表達(dá)載體對AS11進(jìn)行基因互補(bǔ)研究，發(fā)現(xiàn)能夠彌補(bǔ)突變體的缺陷，

50、表型與野生型相似[27]。而對AtDGAT1基因在野生型擬南芥中過量表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，DGAT1轉(zhuǎn)錄水平和活性明顯提高，油脂積累增加10%～70%，種子平均重量增加[26]。目前提高種子中三酰甘油積累的水平，最后一步反應(yīng)是分子操作的主要靶標(biāo)[12]。</p><p><b>　　4．主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)室已利用尼羅紅染色法對寧波大學(xué)微藻種質(zhì)庫

51、的63株微藻進(jìn)行了篩選并跟蹤了其中3株微藻的中性脂積累過程。對微藻中性脂合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶（ACCaseⅠ、ACCaseⅡ）和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）進(jìn)行了研究，包括3株硅藻ACCaseⅠ、ACCaseⅡ和DGAT基因的克隆和序列分析；假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）ACCaseⅠ、ACCaseⅡ和DGAT基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。</p><p>　　研究結(jié)果

52、顯示中性脂的積累與3種關(guān)鍵酶的表達(dá)水平有關(guān)，其中DGAT表達(dá)水平的差異大于ACCaseⅠ和ACCaseⅡ，表明脂類的積累可能與DGAT的表達(dá)更加相關(guān)。 隨后又采用3′RACE和5′RACE的方法得到假微型海鏈藻DGAT基因的cDNA全長序列，經(jīng)BLAST后證明為DGAT基因。</p><p>　　為進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，我們擬構(gòu)建含DGAT基因的異源重組質(zhì)粒，以用于在擬南芥中的表達(dá)分析。主要采用In-Fusion基因

53、克隆法構(gòu)建含DGAT基因的重組質(zhì)粒和含GFP熒光蛋白的DGAT重組質(zhì)粒，將這兩種重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中去侵染野生型擬南芥，從而觀察野生型擬南芥三酰甘油的合成量變化以及DGAT基因在擬南芥中的表達(dá)部位。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Brown C, Knights B A. Hydrocarbon content and

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80、 Arabidomis thaliana affecting diacylglycerol acyltransferase activity[J]．Plant Physiology，1995，108(1)：399—409．</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p>

81、<p>　　假微型海鏈藻DGAT基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p><b>　　引 言1</b></p><p><b>　　1緒論1</b>&l

82、t;/p><p>　　1.1生物柴油的研究現(xiàn)狀1</p><p>　　1.2藻類的特點(diǎn)2</p><p>　　1.3二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT的研究現(xiàn)狀2</p><p>　　1.3.1二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT的特點(diǎn)2</p><p>　　1.3.2DGAT基因?qū)?nèi)脂肪含量的影響2</p&

83、gt;<p>　　1.3.3擬南芥中DGAT活性變化3</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)材料3</b></p><p>　　2.1DGAT片段3</p><p><b>　　2.2菌株3</b></p><p><b>　　2.3質(zhì)粒3</b>

84、;</p><p>　　2.3.1表達(dá)質(zhì)粒3</p><p>　　2.3.2對照質(zhì)粒4</p><p><b>　　2.4引物4</b></p><p>　　2.5藥品和常用藥劑4</p><p>　　2.5.1酶和生化試劑4</p><p>　　2.5

85、.2抗生素4</p><p>　　2.5.3其他試劑4</p><p>　　2.5.4培養(yǎng)基的配制5</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)方法5</b></p><p>　　3.1質(zhì)粒抽提（試劑盒）5</p><p>　　3.2電泳檢測6</p><p&g

86、t;　　3.3質(zhì)粒雙酶切6</p><p>　　3.4DNA片段回收（試劑盒）7</p><p>　　3.5目的基因的獲取7</p><p>　　3.5.1PCR擴(kuò)增目的基因7</p><p>　　3.5.2割膠回收目的基因（試劑盒）8</p><p>　　3.6大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備8&

87、lt;/p><p>　　3.7連接與轉(zhuǎn)化9</p><p>　　3.7.1連接（采用In-Fusion PCR Cloning Kit試劑盒）9</p><p>　　3.7.2轉(zhuǎn)化9</p><p>　　3.7.3PCR檢測重組質(zhì)粒9</p><p><b>　　4結(jié)果9</b>&

88、lt;/p><p>　　4.1目的基因PCR擴(kuò)增10</p><p>　　4.2電泳檢測割膠回收圖10</p><p>　　4.3PCR檢測重組質(zhì)粒10</p><p>　　4.4測序結(jié)果11</p><p><b>　　5小結(jié)11</b></p><p>

89、<b>　　參考文獻(xiàn)13</b></p><p><b>　　附錄15</b></p><p>　　摘要：在高產(chǎn)油微藻假微型海鏈藻中，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是三酰甘油合成途徑的關(guān)鍵酶。本研究試驗(yàn)采用In-Fusion PCR Cloning Kit試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，從而解決pCAMBIA1300表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)在DGAT基

90、因序列的酶切位點(diǎn)上都存在的問題。用XbaⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對pCAMBIA1300質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切得到線性質(zhì)粒。根據(jù)此試劑盒的引物設(shè)計(jì)原理，利用線性表達(dá)質(zhì)粒的序列和已知DGAT基因序列設(shè)計(jì)引物，以用于進(jìn)行DGAT基因的PCR擴(kuò)增，得到目的片段。使用此試劑盒特有的In-Fusion連接酶連接目的片段和表達(dá)質(zhì)粒，該酶不受酶切位點(diǎn)的限制可高效連接目的片段和表達(dá)質(zhì)粒，從而構(gòu)建含假微型海鏈藻DGAT基因的重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒適用于研究擬南芥三酰甘

91、油含量的變化及該基因在擬南芥中的表達(dá)定位。</p><p>　　關(guān)鍵詞：假微型海鏈藻；尼羅紅；乙酰輔酶A羧化酶；二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶</p><p>　　Abstract: Thalassiosira pseudonana is the oleaginous alga,and its diacylglycerol acyltransferase (DGAT) is the key enzy

92、me in synthesis pathway of triglyceride.The experiment constructs recombinantplasmid using In-Fusion PCR Cloning Kit,in order to solve the problem of the multiple cloning sites of pCAMBIA1300 are the same to the restrict

93、ion sites of DGAT. The linear plasmid obtained by double-enzyme cleavage of pCAMBIA1300 plasmid with XbaⅠand KpnⅠ.Based on the principle of primer designing in </p><p><b>　　引言</b></p><

94、p>　　隨著日益嚴(yán)重的環(huán)境惡化,控制汽車尾氣排放和溫室效應(yīng),保護(hù)人類賴以生存的自然環(huán)境成為人類急需解決的問題。同時(shí)全球能源需求不斷擴(kuò)大,尋求可以替代石油在能源結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位的可再生清潔能源是目前普遍關(guān)注的熱點(diǎn)。生物柴油主要以玉米、大豆等農(nóng)作物為主要生產(chǎn)原料，是擺脫對傳統(tǒng)石化能源依賴、減少溫室氣體排放的替代能源。生物柴油是典型“綠色能源”，大力發(fā)展生物柴油對經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，推進(jìn)能源替代，減輕環(huán)境壓力，控制城市大氣污染具有重要的戰(zhàn)略

95、意義。</p><p>　　微藻是一類在水中生長的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽光驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞工廠，通過微藻細(xì)胞高效的光合作用，吸收CO2，將光能轉(zhuǎn)化為脂肪或淀粉等化合物的化學(xué)能，并放出O2。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生長最為迅速的一種低等植物，而且某些微藻可以生長在高鹽、高堿環(huán)境的水體中，可充分利用灘涂、鹽堿地、沙漠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，也可利用海水、鹽堿水、工業(yè)廢水等非農(nóng)用水進(jìn)行培養(yǎng)，還可

96、以利用工業(yè)廢氣中的CO2。因此，微藻生物柴油成為了潛在的能源研究熱點(diǎn)。目前的產(chǎn)油藻主要是葡萄藻（Botryococcus braunii）[1,2]、小球藻（Chlorella pyrenoidosa）[3,4]等。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)室已利用尼羅紅染色法對寧波大學(xué)微藻種質(zhì)庫的63株微藻進(jìn)行了篩選并跟蹤了其中3株微藻的中性脂積累過程。對微藻中性脂合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶（ACCaseⅠ、ACCaseⅡ）

97、和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）進(jìn)行了研究，包括3株硅藻ACCaseⅠ、ACCaseⅡ和DGAT基因的克隆和序列分析；假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）ACCaseⅠ、ACCaseⅡ和DGAT基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。</p><p>　　研究結(jié)果顯示中性脂的積累與3種關(guān)鍵酶的表達(dá)水平有關(guān)，其中DGAT表達(dá)水平的差異大于ACCaseⅠ和ACCaseⅡ，表明脂類的積累可能與DGA

98、T的表達(dá)更加相關(guān)。 隨后又采用3′RACE和5′RACE的方法得到假微型海鏈藻DGAT基因的cDNA全長序列，經(jīng)BLAST后證明為DGAT基因。</p><p>　　為進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，我們構(gòu)建含DGAT基因的異源重組質(zhì)粒，以用于在擬南芥中的表達(dá)分析。主要采用In-Fusion基因克隆法構(gòu)建含DGAT基因的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中去侵染野生型擬南芥，從而觀察野生型擬南芥三酰甘油的合成量變化。</

99、p><p><b>　　1緒論</b></p><p>　　1.1 生物柴油的研究現(xiàn)狀</p><p>　　生物柴油，又稱單烷基脂肪酸酯，是以動(dòng)、植物油脂為原料，與醇類經(jīng)轉(zhuǎn)酯作用獲得的單烷基脂肪酸酯，是一種已經(jīng)得到證明的燃料,以其為可再生性的環(huán)保燃料能源而得到世界的廣泛關(guān)注[5]。與石油柴油等其他燃料液體相比，生物柴油具有優(yōu)良的環(huán)保性、安全性能高、

100、燃燒性能好、可再生性和使用方便等特點(diǎn)。目前,生物柴油主要是以植物和動(dòng)物脂肪酸為原料來生產(chǎn)的,而不是微藻。但是,由油料作物、廢食用油和動(dòng)物脂肪酸生產(chǎn)的生物柴油尚不能滿足當(dāng)前車用燃料需求量的一小部分。面對植物原料生產(chǎn)生物柴油的諸多問題,利用微藻產(chǎn)油具有不與農(nóng)業(yè)爭地的明顯優(yōu)勢,而且可用海水作為天然培養(yǎng)基進(jìn)行大量繁殖。跟植物一樣,微藻也是利用光照產(chǎn)油,但卻比植物作物的效率高很多。</p><p><b>　　1

101、.2 藻類的特點(diǎn)</b></p><p>　　藻類是最低等的、自養(yǎng)的放氧植物，它是低等植物中種類繁多、分布極其廣泛的一個(gè)類群。無論是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮濕的土壤、樹干等處，幾乎在有光和潮濕的任何地方都能生存。藻類通過熱解可獲得生物質(zhì)燃油，是重要的可再生生物能源；通過農(nóng)業(yè)化學(xué)技術(shù)可從一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制備生物柴油和食用油；藻類中還含有多種維生素、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、脂肪酸等成分，是

102、藥用活性物質(zhì)的來源；藻類還可用于污水處理等。地球上的生物每年通過光合作用可固定8x1010噸碳，生產(chǎn)1.46x1011噸的生物質(zhì)，其中40%應(yīng)歸功于藻類的光合作用[3]。因此，藻類生物與人類的生存和發(fā)展有極其密切的關(guān)系，是重要的可再生生物資源。</p><p>　　1.3 二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGAT的研究現(xiàn)狀</p><p>　　1.3.1 二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT的特點(diǎn)</p

103、><p>　　二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是一種甘油?；D(zhuǎn)移酶，該酶與脂肪代謝、脂類在組織中的沉積有很大的關(guān)系，它的主要作用機(jī)制是使二酰甘油（diacylgycerol,DAG）加上脂肪酸?；纬扇８视停╰riacylgycerol,TAG）。在植物中，TAG的合成在種子油脂的形成中起了十分重要的作用[6]。</p><p>