兩株霍亂疑似弧菌的分子鑒別【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　兩株霍亂疑似弧菌的分子鑒別</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p>

2、　　霍亂是由霍亂弧菌所致的烈懷腸道傳染病。主要癥狀是腹瀉、迅速脫水以及嘔吐。弧菌的致病過程包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等，這與弧菌產(chǎn)生的毒力因子有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、莢膜(Capsule)、載鐵體(Siderophore)及外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)等。</p><p>　　霍亂弧菌（Vibrio Chol

3、erae）中的O1群古典生物型(Classical Biotype，CVC)、埃爾托生物型(El Tor Biotype，EVC)和O139群霍亂弧菌能引起慢性腹瀉疾病或造成局域性流行。主要通過飲水、食物和日常生活接觸傳播。如果不當(dāng)食用已感染的水產(chǎn)品容易致病。</p><p>　　霍亂弧菌的潛伏期一般1-2天，短的數(shù)小時，長的5-6天?；魜y弧菌干燥2h或加熱55℃l0min即死亡，煮沸立即死亡。</p>

4、;<p>　　可以使用選擇性培養(yǎng)基TCBS（硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖培養(yǎng)基）對霍亂弧菌進(jìn)行分離純化。</p><p>　　PCR擴(kuò)增弧菌16S rDNA，并結(jié)合CT、zot、ace、slt、tcp、hly等不同毒素基因，外膜蛋白基因ompW，管家基因dnaE、hlyA、mdh、recA等進(jìn)行測序及序列分析。</p><p>　　通過本試驗(yàn)，促進(jìn)霍亂弧菌分類鑒定方法的完善，建立

5、起霍亂弧菌分子鑒別的方法系統(tǒng)，為檢測霍亂弧菌預(yù)防疾病提供技術(shù)依據(jù)。 </p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　?。ㄒ唬┭芯康幕緝?nèi)容</p><p>　　通過16S rRNA基因以及其他基因序列比較分析，分離鑒定兩株養(yǎng)殖塘霍亂弧菌，建立起霍亂弧菌分子鑒別的方法系統(tǒng)，促進(jìn)霍亂弧菌分類鑒定方法的完善，為檢測霍亂弧菌預(yù)防疾病提供技術(shù)依

6、據(jù)。</p><p>　　（二）擬解決的主要問題</p><p>　　分離鑒定兩株霍亂弧菌，建立霍亂弧菌分子鑒別的方法系統(tǒng)。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　研究的方法</b></p><p><b>　　1.菌落分群 </b>&l

7、t;/p><p>　　采集樣品，在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化。</p><p>　　2.菌株形態(tài)特征分析 </p><p>　　對經(jīng)純化的菌株進(jìn)行生理生化分析。</p><p>　　3. 弧菌DNA的提取</p><p><b>　　3.1試劑</b></p><p><

8、b>　　溶菌酶緩沖液：</b></p><p>　　40 mM EDTA，pH 8.0</p><p>　　50 mM Tris-cl，pH 8.0</p><p>　　10％(m/V）蔗糖</p><p>　　用0.22 µm的過濾器過濾除菌，4℃保存。</p><p><b>

9、　　STE緩沖液：</b></p><p>　　10mM EDTA ，pH8.0</p><p>　　25mM Tris-Cl，pH8.0</p><p><b>　　50mM葡萄糖</b></p><p>　　121℃滅菌20 min，4℃保存。</p><p>　　1×工

10、作液，pH 8.0：</p><p>　　1 mM EDTA，pH 8.0</p><p>　　10mM Tris-Cl，pH 8.0</p><p><b>　　TE緩沖液：</b></p><p>　　100 mM Tris-Cl，pH 8.0</p><p>　　10 mM EDTA，pH

11、8.0</p><p>　　10×貯存液，pH 8.0</p><p>　　分裝后121℃滅菌20 min，室溫保存。</p><p>　　3.2 SDS-煮沸法提取DNA</p><p>　　向M1管中加入5 ml STE緩沖液，在漩渦混合器上進(jìn)行充分振蕩；</p><p>　　加1/10體積的20％的SD

12、S溶液(約500 μl），混勻后，用沸水浴2.5 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，-20℃，10 min；</p><p>　　室溫離心，10000 rpm，10 min，棄去上清液；</p><p>　　用600 μl 的1×TE緩沖液溶解沉淀，然后將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中；</p><p>　　加等體積的酚/氯仿/異戊醇

13、溶液(25:24:1，v/v），用手輕輕混勻。離心，10000 rpm，4 min；</p><p>　　收集上清液，然后再加入等體積的氯仿/異戊醇溶液(24:1，v/v）混勻，離心，10000 rpm，4 mi</p><p>　　收集上清液，然后加入1/10體積的3 M的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫沉淀10 min，離心，10000 rpm，10 min；</p>

14、<p>　　用70％乙醇洗滌，然后再次離心，棄去上清液，自然風(fēng)干，加1×TE溶液或無菌雙蒸水溶解DNA，置于-20℃保存；</p><p>　　4. 16S rDNA PCR擴(kuò)增測序 </p><p>　　選用細(xì)菌通用性引物對27f/1541r，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的全序列，其中引物序列見表1。</p><p>　　表1 擴(kuò)增不同16S

15、rDNA片段所用引物列表</p><p>　　Tab. 1 Primers for 16S rDNA amplification</p><p>　　50 μl的PCR反應(yīng)體系組成為：</p><p>　　10×buffer（含Mg2+） 5 μl </p><p>　　正向及反向引物

16、 4 μmol/L</p><p>　　dNTP 200 μmol/L </p><p>　　TaqDNA聚合酶 1 U</p><p>　　模板DNA 50 ng </p><p>　　補(bǔ)雙蒸水至50 μl。&l

17、t;/p><p>　　為獲得較好的特異性產(chǎn)物，采用降落PCR對反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。</p><p>　　PCR反應(yīng)程序（適用于引物對GC+341F和518R）： </p><p>　　94℃，5 min；</p><p>　　94℃，1 min，</p><p>　　60℃，1 min， 降落梯度為0.5℃

18、 10個循環(huán)</p><p>　　72℃，0.5 min；</p><p>　　94℃，1 min，</p><p>　　55℃，1 min， 18個循環(huán)</p><p>　　72℃，0.5 min；</p><p>　　72℃，3 min。</p><p>

19、;　　PCR產(chǎn)物采用1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠（含有0.5 μg/ml溴化乙錠）電泳進(jìn)行檢測，點(diǎn)樣量為4～5 μl。</p><p>　　5. ctxA、toxR其他基因PCR擴(kuò)增測序 </p><p><b>　　6. 序列比較分析</b></p><p><b>　　7.結(jié)論分析</b></p><

20、;p><b>　?。ǘ┘夹g(shù)路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.12 查閱文獻(xiàn)，完成任務(wù)書與開題報(bào)告，制定具體試驗(yàn)計(jì)劃與方案。</p><p>　　2011.01 菌株純化，16S rRNA基因測序。</p><p>　　2011.02 其他標(biāo)記基因PCR擴(kuò)增

21、測序。</p><p>　　2011.03 整理材料、完成2篇外文翻譯、撰寫論文。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Hoffmann M, Brown E W, Feng P C et al.. PCR-based method for targeting 16S-23S rRNA inter

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25、15.</p><p>　　[7] 周德慶. 微生物學(xué)教程[M]. 第二版. 北京: 高等教育出版社, 2002: 355-356.</p><p>　　[8] 巫結(jié)冰, 陳德云, 胡偉寧等. 弧菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行多種弧菌分離鑒定的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007, 17(8): 1451-1452.</p><p>　　[9] 謝群英, 房文紅, 喬振國等

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27、 41.</p><p>　　[12] 焦振全, 劉秀梅. 細(xì)菌分類鑒定的分子生物學(xué)方法研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊. 1996, 23(6): 356-361.</p><p>　　[13] 金莉莉, 董雪, 王秋雨等. 副溶血性弧菌重復(fù)序列-PCR分型研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(3): 389-394.</p><p>　　[14]

28、 杜聯(lián)峰, 楊澤, 余妍等. 霍亂弧菌多重PCR檢測方法的建立及優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 37(1): 101-102,114.</p><p>　　[15] 劉毅, 韓金祥, 黃海南等. 膜微陣列技術(shù)的建立及檢測細(xì)菌條件的優(yōu)化[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2003, 21(4): 221-223.</p><p>　　[16] 王洪敏, 柯昌文, 潘武濱等. 2005年廣東省

29、臨床分離豬鏈球菌的MLST分子分型研究[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(8): 1438-1441, 1445. </p><p>　　[17] 劉靜. AFLP分子標(biāo)記的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 5: 10-14.</p><p>　　[18] Pascual J, M.Carmen Macián, Arahal D R et al..

30、Multilocus sequence analysis of the central clade of the genus Vibrio by using 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB and toxR genes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60: 1

31、54.</p><p>　　[19] Thompson F L, Bruno Gomez-Gil, Ana Teresa Ribeiro Vasconcelos et al.. Multilocus sequence analysis reveals that Vibrio harveyi and V.campbellii form distinct species[J]. Applied & Envir

32、onmental Microbiology, 2007, doi: 10. 1128 / AEM. 00020-07.</p><p>　　[20] Serrano W, Amann R, RamonRossello´-Mora et al.. Evaluation of the use of multilocus sequence analysis(MLSA) to resolve taxonomic

33、 conflicts within the genus[J]. Marichromatium.Systematic and Applied Microbiology, 2010, 33(3): 116–121.</p><p>　　[21] Shirai H, Nishibuchi M, Ramamurthy T et a1.. Polymerase chain reactionfor detection oft

34、he cholera enterotoxin operon of vibrio cholerae[J]. J Clin Microbiol, 1991, 29: 27-30.</p><p>　　[22] Ramamurthy T, Pol A, Bag P K et a1.. Detection of cholera toxin gene instool specimens by polymerase chai

35、n reaction：comparision with bead enzymelinked immunosorbent assay and culture method for laboratory diagnosis of cholera[J]. J Clin Mierobiol, 1993, 31: 3-6.</p><p>　　[23] Dziejman M, Bakon E, Boyd D et a1..

36、 Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 3: 166-181.</p><p>　　[24] Sweswar N, Ranjank K N,

37、Sarmisht H M et a1.. Rapid method for species—specific iden—tification of Vibrio cholerae using primem targeted to the gene of outer membrane protein ompW[J]. J Clin Micro, 2000, 38: 145-151.</p><p>　　[25]

38、Guo C L, Wang T, Peng Q et a1.. The Phylotype of Thermus from the Rehai Geothermal Area,</p><p>　　Tengchong,China [J]. The Joumal of Microbiology, 2003, 41(2): 152-156.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜

39、述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p><b>　　弧菌分類鑒定的進(jìn)展</b></p><p>　　摘要：弧菌是一類水生環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陰性菌，是很多生物體的致病菌。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，弧菌分類鑒定的方法越來越多，也越來越深入，本文通過對現(xiàn)有的弧菌的分類鑒定方法進(jìn)行羅列

40、總結(jié)并提出了弧菌分類鑒定方法的發(fā)展方向。</p><p>　　關(guān)鍵字：弧菌；16SrRNA；MLSA；全基因組序列；序列分析；分類</p><p><b>　　1 弧菌簡介</b></p><p>　　弧菌是一類廣泛分布于自然界，尤以水生為多的革蘭氏陰性菌?；【疲╒ibrionaseae）大多數(shù)為氧化酶陽性，有端鞭毛、動力陽性?；【鷮伲╒ib

41、rio）分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對弧菌抑制劑O/129（二氨基二異丙基喋啶）敏感。</p><p>　　由意大利人Filippo Pacini發(fā)現(xiàn)第一種弧菌以來，至今已超過74種弧菌被發(fā)現(xiàn)[1]。</p><p>　　某些弧菌是人及水產(chǎn)動物的致病菌。如副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、河弧菌(Vibrio Fluvialis)等能引起食物中毒；鰻弧菌(Vibr

42、io Anguillarum) 、鮭弧菌(Vibrio Salmonicida)、哈維氏弧菌（Vibrio Harveyi）等是某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病原菌；霍亂弧菌（Vibrio Cholerae）中的O1群古典生物型(Classical Biotype，CVC)、埃爾托生物型(El Tor Biotype，EVC)和O139群VC能引起慢性腹瀉疾病或造成局域性流行[2]?；魜y弧菌的潛伏期一般1-2天，短的數(shù)小時，長的5-6天。霍亂弧菌干

43、燥2h或加熱55℃lOmin即死亡，煮沸立即死亡[3]。</p><p>　　弧菌的致病過程包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等，這與弧菌產(chǎn)生的毒力因子有關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、莢膜(Capsule)、載鐵體(Siderophore)及外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)等[4]。</p><p>　　

44、某些海洋弧菌（如Vibrio Pacini）可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶[5]，進(jìn)而分解幾丁質(zhì)增加海洋中氨基糖的來源。還有的弧菌能產(chǎn)抗生素，降解多元環(huán)芳香烴以及為某些水生生物提供多不飽和脂肪酸。</p><p><b>　　2 弧菌的分類鑒定</b></p><p>　　根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊（第二版，2004年），弧菌屬于γ-變形菌綱，弧菌科有8個屬，弧菌屬包括51個種。2003

45、年，Thompson等通過16S rRNA序列和表型特征分析把弧菌分為3個科。2004年，Thompson等通過16S rRNA，recA與rpoA基因序列分析把弧菌分為4個科（Salinivibrioaceae，Enterovibrioaceae，Photobacteriaceae，Vibrionaceae）[6]。其中Vibrionaceae只有一個含63種弧菌的弧菌屬。 </p><p>　　微生物分類鑒

46、定方法主要有4種：在表型特征水平上，通過觀察微生物的形態(tài)特征、運(yùn)動性、酶反應(yīng)、營養(yǎng)要求、生長條件、代謝特性、致病性、抗原性和生態(tài)學(xué)特性等進(jìn)行鑒定的方法；在細(xì)胞組分水平上，對細(xì)胞壁、脂類、醌類和光合色素等的鑒定；在蛋白質(zhì)水平上，有氨基酸序列分析、凝膠電泳和各種免疫標(biāo)記技術(shù)等；在核酸水平上，包括G+Cmol%值的測定，核酸分子雜交，16S或18S rRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因組測序等[7]。</p>&l

47、t;p>　　2.1 表型特征分類鑒定</p><p>　　目前主要使用增菌液和選擇性培養(yǎng)基分離檢測弧菌。根據(jù)巫結(jié)冰等人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用CV培養(yǎng)基（科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基）可同時對海(水)產(chǎn)品進(jìn)行多種弧菌的檢測[8]，另外也可以用無營養(yǎng)鹽的海水雙層瓊脂平板法[9]及選擇性培養(yǎng)基TCBS（硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖培養(yǎng)基）進(jìn)行檢測[10][11]。</p><p>　　2.2 分子水平上的分類鑒

48、定</p><p>　　在對弧菌的分類鑒定上，可采用API 20E和Biolog GN等生理生化標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；也可采用DNA-DNA雜交(DNA-DNA Hybridization,DDH)[12]，RFLP（Random Fragment Length Polymorphism)，微陣列技術(shù)（Microarray），長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism

49、，AFLP)，基因外重復(fù)回文系列PCR（Repetitive Extragenic Palindrome PCR，rep-PCR）[13]，多位點(diǎn)酶電泳法(Multilocus Enzyme Electrophoresis，MLEE)，多位點(diǎn)序列分析（Multilocus Sequence Typing，MLST)，多重PCR（Multiplex PC）[14]等在分子水平上進(jìn)行鑒定。</p><p>　　DDH

50、在弧菌分類學(xué)中只有當(dāng)DNA-DNA的相似性高于80%時，才會被定義為相同的種，但是每次新實(shí)驗(yàn)都需要選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株。</p><p>　　微陣列(Microarmy)是指將許多特定的寡核苷酸探針有規(guī)律地排列固定于支持物(如膜、硅片及玻片)上，然后與待測的標(biāo)記樣品按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過檢測系統(tǒng)對其進(jìn)行掃描，進(jìn)行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究[15]。</p><p&

51、gt;　　MLEE于19世紀(jì)80年代開始被應(yīng)用于細(xì)菌分型，是根據(jù)一個基因一種酶的學(xué)說，編碼酶的染色體結(jié)構(gòu)基因的多態(tài)性也表現(xiàn)為酶的多態(tài)性，通過對酶分子量和電荷的變異情況，推算其對應(yīng)的基因位點(diǎn)的多態(tài)性，并經(jīng)過多個酶基因的位點(diǎn)的綜合分析，獲得細(xì)菌的基因型。</p><p>　　MLST是通過對管家基因直接進(jìn)行測序比較對細(xì)菌進(jìn)行分型，該法具有分辨率高、序列數(shù)據(jù)明確可靠、數(shù)據(jù)重復(fù)性好、結(jié)果便于實(shí)驗(yàn)室之間交流比較、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

52、和管理方便等優(yōu)點(diǎn)[16]。MLEE檢測的是整個編碼基因的活性，而MLST分析時往往只對某個基因的一部分進(jìn)行測序分析。</p><p>　　MLSA（Multilocus Sequence Analysis）是在MLST基礎(chǔ)上發(fā)展而來，通過對多個編碼蛋白基因的測序鑒定弧菌。另外，用超級樹（Supertree）的方法也具有極高的可信度。</p><p>　　AFLP是在RAPD和RFLP基礎(chǔ)上

53、發(fā)展起來的，起初使用放射性物質(zhì)標(biāo)記的引物，現(xiàn)在多使用熒光標(biāo)記的引物。通過對基因組DNA雙酶切后的限制性片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，再對擴(kuò)增片段電泳后形成的圖譜進(jìn)行比較，在基因組水平揭示細(xì)菌之間的多樣性。AFLP技術(shù)能同時檢測到大量的位點(diǎn)和多態(tài)性標(biāo)記，具有覆蓋面廣、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因組產(chǎn)生標(biāo)記、標(biāo)記的分離遵循孟德爾遺傳規(guī)律等優(yōu)點(diǎn)[17]。然而這種技術(shù)的普及性不是很好，僅限于世界上幾個實(shí)驗(yàn)

54、室在使用，而且實(shí)驗(yàn)室之間指紋帶型的比較也是很困難的，成為一種通用的網(wǎng)上可用的電子分類學(xué)工具并不容易。</p><p>　　rep-PCR主要用于擴(kuò)增基因組中高度重復(fù)序列的中間序列，Wong和Lin比較了RAPD、rep-PCR與PFGE這三種方法，發(fā)現(xiàn)rep-PCR具有最高的分辨能力。然而，這項(xiàng)技術(shù)不僅只限于世界上幾個實(shí)驗(yàn)室在使用，而且它也主要應(yīng)用于對于Vibrio Alginolyticus，Vibrio Ch

55、olerae， Vibrio Vulnificus等菌的鑒定。 </p><p>　　另外，利用16S rRNA只能對弧菌精確地鑒定至科與屬的水平，需結(jié)合其他標(biāo)志分子有hsp60，gyrB，recA，rpoA，rpoB，atpA，dnaJ，lux，toxR[18][19][20]等能更精確地鑒定出弧菌。因?yàn)榛【浦?6S rRNA的相似性高于97.6%，有些種之間的的相似性甚至達(dá)到100%。在霍亂弧菌PCR檢測方

56、面，CT、zot、ace、slt、tcp、hly[21][22][23] 等不同毒素基因用于快速檢測產(chǎn)毒素的霍亂弧菌；外膜蛋白基因ompW用以檢測各種霍亂弧菌[24]。</p><p>　　而郭春雷等人[25]對幾株棲熱菌屬(Thermus)的菌株和該屬一些有效發(fā)表種進(jìn)行了基于16S rRNA的部分區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)比較分析，利用內(nèi)環(huán)、內(nèi)環(huán)與發(fā)卡環(huán)之間堿基對數(shù)目以及發(fā)卡環(huán)的堿基數(shù)目區(qū)分種間差異，證明16S rRNA二

57、級結(jié)構(gòu)可以用來區(qū)分種一級的分類單位。</p><p>　　2002年，細(xì)菌菌種定義復(fù)評特別委員會（ad hoc committee for re-evaluation of the species definition in bacteria）規(guī)定，至少要對其染色體上的五個基因進(jìn)行分析才能將一株細(xì)菌劃分至種的水平。</p><p>　　總而言之，DDH，F(xiàn)AFLP，rep—PCR，MLSA

58、等比傳統(tǒng)的表型特征分析更可靠，但是并不能通過因特網(wǎng)建立使許多分類學(xué)家可用的信息。</p><p>　　3 弧菌分類鑒定的發(fā)展方向</p><p>　　在現(xiàn)有的對弧菌鑒定的方法上，還需要做出很大的努力以期更精確更方便更高效地鑒定弧菌。尋找新的用于精確鑒定弧菌個體間差異的標(biāo)志分子是一個很重要的方面。而16S rRNA的高級結(jié)構(gòu)的研究極有可能對弧菌的精確鑒定帶來新的里程碑。</p>

59、<p>　　另外，全基因組序列的測定必然會對弧菌的精確分類鑒定帶來全新的認(rèn)識。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Hoffmann M, Brown E W, Feng P C et al.. PCR-based method for targeting 16S-23S rRNA intergenic spacer

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69、;<p>　　[19] Thompson F L, Bruno Gomez-Gil, Ana Teresa Ribeiro Vasconcelos et al.. Multilocus sequence analysis reveals that Vibrio harveyi and V.campbellii form distinct species[J]. Applied & Environmental Mic

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75、 et a1.. Rapid method for species—specific iden—tification of Vibrio cholerae using primem targeted to the gene of outer membrane protein ompW[J]. J Clin Micro, 2000, 38: 145-151.</p><p>　　[25] Guo C L, Wan

76、g T, Peng Q et a1.. The Phylotype of Thermus from the Rehai Geothermal Area,</p><p>　　Tengchong,China [J]. The Joumal of Microbiology, 2003, 41(2): 152-156.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b><

77、;/p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　兩株霍亂疑似弧菌的分子鑒別</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘要（Abstract）</p><p><b>　　1 引言1</b></p>

78、<p>　　1.1 弧菌簡介1</p><p>　　1.2 霍亂弧菌簡介1</p><p>　　1.3 霍亂弧菌鑒別方法1</p><p><b>　　2 材料與方法1</b></p><p><b>　　2.1 材料1</b></p><p>　　2

79、.1.1 樣品1</p><p>　　2.1.2 主要試劑及其配制1</p><p>　　2.1.3 主要儀器2</p><p><b>　　2.2 方法3</b></p><p>　　2.2.1 菌株的分離純化3</p><p>　　2.2.2 DNA提取3</p>&

80、lt;p>　　2.2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增測序3</p><p>　　2.2.4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析4</p><p>　　2.2.5其他基因測序分析4</p><p><b>　　3 結(jié)果和分析5</b></p><p>　　3.1弧菌的分離純化5</p>&l

81、t;p>　　3.2 16S rRNA基因序列分析5</p><p>　　3.3 其他基因序列分析8</p><p><b>　　4 討論8</b></p><p>　　致謝：錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)9</b></p><p>&

82、lt;b>　　附錄10</b></p><p>　　附錄一 16S rRNA的PCR擴(kuò)增序列10</p><p>　　摘要：霍亂弧菌是海產(chǎn)品的主要致病菌株之一。具有致病性的菌種主要有O1群埃爾托型、古典型和O139群。本研究從象山港口采集水樣和底泥樣品作為實(shí)驗(yàn)材料，在弧菌的選擇性培養(yǎng)基TCBS上進(jìn)行分離純化，分離得到7株弧菌。再進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增測序

83、。接著構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒別出菌株NH87-21_和菌株4為霍亂弧菌。最后查閱相關(guān)文獻(xiàn)，推測菌株NH87-21_和菌株4為O1群埃爾托型霍亂弧菌。通過本研究，初步鑒定出菌株NH87-21_和菌株4均為霍亂弧菌，同時確認(rèn)了16S rRNA基因可以用于霍亂弧菌的分子鑒別。</p><p>　　關(guān)鍵詞：弧菌；霍亂弧菌；16S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育分析</p><p>　　Abstract：Vib

84、rio Cholerae is one of the primary pathogenic strains to marine products. Only Vibrio Cholerae O19, O1 El Tor and classical biotypes are pathogenic. In this study, water samples and bottom sediment samples collected from

85、 the Xiangshan Port were choosed as the experimental materials. And we islated seven strains in Vibrio selective medium. After that, 16S rRNA gene PCR was followed by the sequencing. Than we buit the Phylogenetic Tree an

86、d identified strain NH87-21_ and strain 4 as Vib</p><p>　　Keywords：Vibrio; Vibrio Cholerae; 16S rRNA gene; phylogenetic analysis</p><p><b>　　1 引言</b></p><p><b>　　1

87、.1 弧菌簡介 </b></p><p>　　弧菌是一類廣泛分布于自然界，尤以水生為多的革蘭氏陰性菌?；【疲╒ibrionaseae）大多數(shù)為氧化酶陽性，有端鞭毛、動力陽性?；【鷮伲╒ibrio）分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，對弧菌抑制劑O/129（二氨基二異丙基喋啶）敏感。</p><p>　　某些弧菌是人及水產(chǎn)動物的致病菌。如副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyt

88、icus）、河弧菌(Vibrio Fluvialis)等能引起食物中毒；鰻弧菌(Vibrio Anguillarum) 、鮭弧菌(Vibrio Salmonicida)、哈維氏弧菌（Vibrio Harveyi）等是某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病原菌。</p><p>　　1.2 霍亂弧菌簡介</p><p>　　霍亂是一種由霍亂弧菌（Vibrio Cholerae）引起的急性腸道病。主要癥狀是腹瀉

89、、迅速脫水以及嘔吐?；【闹虏∵^程包括黏附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等，這與弧菌產(chǎn)生的毒力因子有關(guān)[1]。目前發(fā)現(xiàn)的弧菌毒力因子有外毒素(Exotoxin)、蛋白酶(Protease)、莢膜(Capsule)、載鐵體(Siderophore)及外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)等。</p><p>　　霍亂弧菌共有200多種血清型[2]，其中能引起霍亂的只有O1群古典生物型(Clas

90、sical Biotype，CVC)、埃爾托生物型(El Tor Biotype，EVC)和O139群[3]。自17世紀(jì)以來，霍亂已經(jīng)在世界上發(fā)生了七次大流行。前六次均是由O1群古典生物型引起?，F(xiàn)在正處于開始于1961年以印度尼西亞蘇拉威西島為發(fā)源地的第七次大流行期間，由O1群埃爾托生物型引起。1992年印度首次發(fā)生了由O139群引起的霍亂大爆發(fā)[4]。</p><p>　　1.3 霍亂弧菌鑒別方法</p&

91、gt;<p>　　當(dāng)前對霍亂弧菌進(jìn)行分子分型的主要方法有主要多位點(diǎn)酶電泳法（MLEE）、核糖體分型（RT）、脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）和基于聚合酶鏈反應(yīng)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、基因外重復(fù)序列-PCR（REP-PCR）、腸道細(xì)菌重復(fù)性基因內(nèi)一致性序列-PCR(ERIC-PCR)、盒式-PCR[5]、低頻限制性位點(diǎn)-PCR（IRS-PCR）、多基因位點(diǎn)分型技術(shù)（MLST）[6]等。&l

92、t;/p><p>　　16S rRNA基因通過PCR，加入特定引物測序再構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定細(xì)菌的種類[7]。</p><p>　　霍亂弧菌霍亂毒素A亞單位基因ctxA、小帶聯(lián)結(jié)毒素基因zot、輔助霍亂腸毒素基因ace、霍亂弧菌毒素共調(diào)菌毛基因tcpA、毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因toxR等毒素相關(guān)基因已經(jīng)應(yīng)用于霍亂弧菌分型分析[8]。</p><p>　　Bisweswa

93、r等人通過PCR擴(kuò)增顯示，全部檢樣霍亂弧菌的外膜蛋白基因ompW陽性，98%為toxR陽性[9]。 </p><p>　　本文采用16S rRNA基因PCR擴(kuò)增進(jìn)而進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]，結(jié)合其他基因分析，確定出菌株種類。建立起霍亂弧菌分子鑒別的方法系統(tǒng)，為檢測霍亂弧菌預(yù)防疾病提供技術(shù)依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b><

94、/p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p><b>　　2.1.1 樣品</b></p><p>　　從象山港口采集水樣和底泥樣品用于弧菌的分離。</p><p>　　2.1.2 主要試劑及其配制</p><p>　　TCBS培養(yǎng)基：酵母膏5 g，蛋白胨10

95、g，蔗糖20 g，硫代硫酸鈉10 g，檸檬酸鈉10 g，牛膽酸鈉3 g，牛膽汁粉5 g，氯化鈉10 g，檸檬酸鐵1 g，溴麝香草酚藍(lán)（2%溶液）20 mL，草酚藍(lán)（1%溶液）4 mL，瓊脂15 g，調(diào)整pH 7.0，高溫高壓滅菌后冷卻，倒平板。</p><p>　　LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)整PH7.0，高溫高壓滅菌后4 ℃保存；</p>&

96、lt;p>　　10×TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl，1.00 mmol/L EDTA，121℃滅菌20 min后4 ℃保存；</p><p>　　Rnase A 溶液：將Rnase A溶于10 mol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，15 mmol/L Nacl中，配成10 mg/ml的溶液，100 ℃加熱15分鐘，冷卻后用1.5 mL離心管分裝成小份保存于-20 ℃。&l

97、t;/p><p>　　10%SDS：SDS 10%，pH 7.2，室溫保存；</p><p>　　NaAC：5 mol/l，高溫高壓滅菌，4 ℃保存；</p><p>　　CTAB/NaCl溶液：10% CTAB，0.7 M NaCl。在80 ml雙蒸水中溶解4.1 g NaCl，然后緩慢加入10 g CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，同時加熱并攪拌，加熱至65 ℃溶

98、解，定容至100 ml；</p><p>　　酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）(體積比)，4 ℃避光短期保存；</p><p>　　氯仿/異戊醇 （24:1）（體積比），4 ℃保存；</p><p>　　NaAC 5mol/l 高溫高壓滅菌，4 ℃保存；</p><p>　　Taq DNA聚合酶(5 units. μL-1)、dNTPs（d

99、ATP、dGTP、dCTP、dTTP均10 mmol.L-1）、10×PCR Buffer均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；</p><p>　　溶菌酶緩沖液：40 mM EDTA，pH 8.0；50 mM Tris-cl，pH 8.0；10％(m/V）蔗糖，用0.22 µm的過濾器過濾除菌，4 ℃保存。</p><p>　　2.1.3 主要儀器</p>

100、;<p>　?。?）BIO-RAD梯度PCR儀（PTC0100）</p><p>　?。?）Eppendorf微量移液器</p><p>　　（3）Eppendorf centrifuge 冷凍離心機(jī)（5415R）</p><p>　?。?）Eppendorf centrifuge 離心機(jī)（5415D）</p><p>　　（5

101、）電泳儀（BG—Power600i），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品</p><p>　?。?）電子天平（AL104），梅特勒—托利多儀器有限公司產(chǎn)品</p><p>　　（7）臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL—16M），長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司</p><p>　　（8）紫外可見分析裝置</p><p>　?。?）電熱恒溫水槽(DK—8D型)，上

102、海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品</p><p>　?。?0）超低溫冷凍冰箱</p><p>　?。?1）RXZ智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品</p><p><b>　?。?2）水平搖床 </b></p><p>　　（13）XYJ—875凈化工作臺（GB6168—85），蘇州市偉業(yè)空調(diào)凈化有限公司產(chǎn)品</p&g

103、t;<p>　?。?4）微電腦智能化控制新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG—9123A），寧波江南儀器廠產(chǎn)品</p><p>　?。?5）手掌型離心機(jī)（LX—100）</p><p>　?。?6）Galanz微波爐（PTO23TP—KT），佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司</p><p>　?。?7）各種規(guī)格Tips、Tubes和培養(yǎng)皿等</p&

104、gt;<p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 菌株的分離純化</p><p>　　將水樣和底泥樣品經(jīng)生理鹽水按梯度稀釋，接種至平板上，每個梯度做三個重復(fù)，用劃線法接種在TCBS培養(yǎng)基倒的平板上，在培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)兩天，挑出單菌落接種在新的TCBS培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)到得單菌落作為下一步的實(shí)驗(yàn)對象。</p&

105、gt;<p>　　2.2.2 DNA提取</p><p>　　（1）從平板上挑取單菌落至大試管LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h左右，取10 ml培養(yǎng)液，10,000 g離心2 min；</p><p>　?。?）加入2 ml TE懸浮沉淀菌體，再加入100 μl溶菌酶（50 mg/ml）、10 μl Rnase A (10 mg/ml)，搖勻，37 ℃ 水浴30 min；<

106、;/p><p>　　（3）加入120 μl 10%SDS和10 μl蛋白酶K(20 mg/ml)，混勻，60 ℃水浴30 min-1 h。注意觀察粘稠度增加和破壁效果；</p><p>　?。?）加入500 μl 5 mol/L NaCl，320 μl CTAB/NaCl，65 ℃水浴10 min；</p><p>　?。?）3 ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次；4

107、 ℃，12,000 g離心10 min；</p><p>　?。?）轉(zhuǎn)移上清后用等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提2-3次；4 ℃，12,000g離心10 min；</p><p>　?。?）加入1/10體積的(3 mol/L)NaAC，0.6體積異丙醇（或1體積的無水乙醇）沉淀DNA；4 ℃，12,000g離心1 min；</p><p>　　（8）用70%的酒精洗

108、少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗滌弄起DNA沉淀，混勻充分后洗滌。第三次重新洗滌，盡量減少DNA里面的鹽分和其他雜質(zhì)；</p><p>　　（9）所得的沉淀DNA用50 μl水溶解，加入50 μl的5 mol/l的NaCl溶液，充分混勻。加入0.6倍體積的異丙醇沉淀后重新70%酒精洗滌；</p><p>　?。?0）風(fēng)干后，用50 μl水溶解樣品，-20℃保藏備用。&

109、lt;/p><p>　　2.2.3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增測序</p><p>　　選用細(xì)菌通用性引物對27f/1541r，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的全序列，其中引物序列見表1。</p><p>　　表1 擴(kuò)增不同16S rDNA片段所用引物列表</p><p>　　Tab. 1 Primers for 16S rDNA amplific

110、ation</p><p>　　50 μl的PCR反應(yīng)體系組成為：</p><p>　　10×buffer（含Mg2+） 5 μl </p><p>　　正向及反向引物 4 μmol/L</p><p>　　dNTP 2