納米tio2對四膜蟲細胞毒性分子機理的研究【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　納米TiO2對四膜蟲細胞毒性分子機理的研究</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物技術 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</

3、b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　ABSTRACT錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言4</b></p><p><b>　　1 材料與方法5</b></p><p>　　1.1 實驗材料

4、5</p><p>　　1.1.1 實驗生物5</p><p>　　1.1.2 試劑5</p><p>　　1.1.2.1 四膜蟲培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基基本配方為(表1)：5</p><p>　　1.1.2.2 PBS的配制(表2)：5</p><p>　　1.1.2.3 勻漿介質(zhì)的配制(表3)：5</p

5、><p>　　1.1.2.4其他試劑及材料5</p><p>　　1.1.3儀器與設備6</p><p>　　1.2 實驗方法6</p><p>　　1.2.1 四膜蟲的培養(yǎng)6</p><p>　　1.2.2 四膜蟲酶液的提取及測定6</p><p>　　1.2.2.1 四膜蟲酶液的提取

6、6</p><p>　　1.2.2.2 酶活力計算方法6</p><p>　　1.2.3 四膜蟲RNA的提取和基因檢測6</p><p>　　1.2.3.1 四膜蟲RNA的提取6</p><p>　　1.2.3.2 基因的檢測7</p><p>　　1.3 數(shù)據(jù)處理7</p><p>

7、<b>　　2 結(jié)果8</b></p><p>　　2.1 不同濃度納米TiO2對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力的影響8</p><p>　　2.2 不同濃度納米TiO2對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響8</p><p>　　2.3 不同濃度納米TiO2對四膜蟲mdr1及hsp70基因表達的影響9</p>&l

8、t;p><b>　　3 討論12</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附錄一 文獻綜述錯誤!未定義書簽。</p><p>　　摘要：本實驗以四膜蟲為材料，研究了不同濃度的納米TiO2對其生長、生理代謝及相關基因的影響。結(jié)果表明，四個濃度組的納米TiO2 (1 mg·L-1、10 mg&

9、#183;L-1、100 mg·L-1、500 mg·L-1)對四膜蟲乙酰膽堿酯酶和琥珀酸脫氫酶活力均有抑制作用，隨著濃度的增大，抑制作用越強，且500 mg·L-1濃度的納米TiO2抑制作用最強。當用不同濃度的納米TiO2處理四膜蟲后，從1 mg·L-1的納米TiO2濃度起，MDR1的表達量明顯增多； 1 mg·L-1的納米TiO2使HSP70的表達量增大，而500 mg·L

10、-1的納米TiO2使HSP70的表達量減少。</p><p>　　關鍵詞：納米TiO2；四膜蟲；毒性</p><p>　　Abstract: Tetrahymena was used as material in this experiment and effects of different concentration of Nano-TiO2 on its growth, physio

11、logical metabolism and related gene were studied. Results showed that four concentration group of Nano-TiO2 (1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1、500 mg·L-1) could exhibit the activity of acetylcholinestera

12、se and succinate dehydrogenase in Tetrahymena cells, the effect of inhibition was stronger as the concentration increased, and the inhibition was strongest when conc</p><p>　　Keywords: Nano-TiO2; Tetrahymena

13、 pyriformis; cytotoxicity </p><p><b>　　引言</b></p><p>　　納米材料是指幾何尺寸達到納米級水平，并具有特殊性能的材料。1納米(nm)是10-9m。當前對納米材料的定義是：粒徑為1-100nm的納米粉、納米線，厚度為1-100nm的納米薄膜，并且會產(chǎn)生納米效應的材料[1]。納米材料由于其在傳導性、反應性和光敏性上

14、表現(xiàn)出與眾不同的特性，使得納米科學與信息科學和生物科學并列，成為21世紀的三大支柱學科，納米技術的發(fā)展也被成為“工業(yè)革命”[2]。</p><p>　　納米TiO2是指特征維度尺寸在納米數(shù)量級的二氧化鈦顆粒，它具有比表面積大、磁性強、光吸收性好，熱導性好、分散性好等性能，因而備受國內(nèi)外研究者的關注。納米TiO2有三種晶體結(jié)構(gòu)，即銳鈦礦、金紅石及板鈦礦，它們組成結(jié)構(gòu)的基本單位是TiO6八面體[3]。納米TiO2是納

15、米材料中應用十分廣泛的材料之一，在日用化妝品、涂料、環(huán)保等方面有著廣闊的應用前景，由于其光物理性質(zhì)而應用于工業(yè)添加劑[4,5,6]。</p><p>　　目前，國內(nèi)對納米TiO2的生物效應研究還處于起步階段，國外研究的歷史也只有20年左右。根據(jù)已有的研究證實：(1). 納米TiO2具有尺寸效應，其粒徑越小，對生物的毒性效應越大，濃度超出一定的范圍也會引起生物的效應[7]。(2). 目前研究納米TiO2顆粒對生物的

16、影響及生物效應的受試生物主要為小鼠和細胞，對水生生物及細菌的研究較少[8-14]。(3). TiO2的生物效應研究局限于毒性的表征，對其作用機制的研究不夠深入，對其分析相對薄弱[15-21]。</p><p>　　隨著納米TiO2的廣泛使用，越來越多的納米TiO2無論是以何種形式釋放，其最終都會進入到水環(huán)境中，使用納米材料可能導致排放到水環(huán)境，并危及水生物與水生生態(tài)系統(tǒng)。因此，其對水生生物及水生生態(tài)系統(tǒng)是否有影響

17、，就是值得關注的問題。</p><p>　　梨形四膜蟲是真核單細胞原生動物，分布在全球的淡水水域中，由于其生長迅速，生活周期短，取材容易，培養(yǎng)方法簡單、經(jīng)濟、便捷，實驗結(jié)果又相對準確，而且對許多毒物的響應比其他高等生物更為敏感、直接；使其越來越受到毒理學與生態(tài)毒理學家的關注和重視[22-25]，開展以四膜蟲為模型的毒理學與生態(tài)毒理學研究具有很大的科學價值。本實驗希望通過納米TiO2對四膜蟲的生長、生理代謝及相關基

18、因的研究,為該領域的研究提供參考,積累數(shù)據(jù),更為深入了解納米TiO2的毒性及其機制提供基礎依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 實驗材料</b></p><p>　　1.1.1 實驗生物</p><p>　　四膜蟲(Tetrahymena p

19、yriformis)由中科院武漢水生生物研究所原生動物實驗室饋贈。</p><p><b>　　1.1.2 試劑</b></p><p>　　1.1.2.1 四膜蟲培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基基本配方為(表1)：</p><p>　　表1 四膜蟲培養(yǎng)基基本配方</p><p>　　取蒸餾水定容至1L，PH值調(diào)到7.0，分裝

20、后121℃滅菌，后保存于4℃冰箱，待用。</p><p>　　1.1.2.2 PBS的配制(表2)：</p><p>　　表2 PBS的配制</p><p>　　取蒸餾水定容至1L，PH值調(diào)到7.4，后121℃滅菌，后保存于4℃冰箱，待用。</p><p>　　1.1.2.3 勻漿介質(zhì)的配制(表3)：</p><p

21、>　　表3 勻漿介質(zhì)的配制</p><p>　　1.1.2.4其他試劑及材料</p><p>　　納米TiO2(購于杭州大洋納米新材料有限公司)；乙酰膽堿酯酶(True choline esteras; TChE)測定試劑盒、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase; SDH)測試盒(購于南京建成生物科技有限公司)； Trizol RNA提取試劑盒，Prim

22、e ScriptR one step RT-PCR Kit Ver.2(購于TaKaRa公司)； RNA酶抑制劑，異丙醇，氯仿，75％乙醇，DEPC水等。</p><p>　　1.1.3儀器與設備</p><p>　　光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、722型分光光度計、高壓蒸汽滅菌鍋、臺式高速離心機、電子分析天平、超聲細胞粉碎機、PCR儀、電泳儀</p><p>　　其他常

23、用儀器：移液器槍、玻璃試管、錐形瓶、量筒、容量瓶、燒杯、玻璃棒、攪拌器等</p><p><b>　　1.2 實驗方法</b></p><p>　　1.2.1 四膜蟲的培養(yǎng)</p><p>　　四膜蟲先于26℃，靜止培養(yǎng)3天，培養(yǎng)到其對數(shù)生長期待用。接種前將分裝好培養(yǎng)基的錐形瓶滅菌，實驗使用250mL的錐形瓶，采用上述培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。錐形瓶每瓶

24、接入8~9mL四膜蟲蟲液。</p><p>　　納米TiO2濃度設置：實驗共設置5個質(zhì)量濃度梯度，分別是0(對照)、1、10、100、500 mg/L，每個濃度組設置三個重復。</p><p>　　1.2.2 四膜蟲酶液的提取及測定</p><p>　　1.2.2.1 四膜蟲酶液的提取</p><p>　　(1). 以5000r/min離心2

25、0分鐘沉淀蟲體，將收集到的細胞用預冷的PBS洗滌三次，每次洗滌的過程同樣5000r/min離心；</p><p>　　(2). 去上清，加入500uL勻漿介質(zhì)，在冰浴中低速勻漿3分鐘；</p><p>　　(3). 將細胞裂解液4000r/min離心10分鐘，取上清；</p><p>　　(4). 根據(jù)試劑盒提供的方法，在紫外分光光度計上測定TChE和SDH的活力。

26、</p><p>　　1.2.2.2 酶活力計算方法</p><p>　　(1). 組織勻漿中TChE活力=（測定管OD值—對照管OD值）/（標準管OD值—空白管OD值）標準管濃度(1mol·ml-1) 勻漿蛋白含量（mgprot·ml-1）</p><p>　　(2). 組織勻漿中SDH活力=（OD1值—OD2值）/(0.01反應時間) 取樣量

27、中蛋白含量（mgprot·ml-1）</p><p>　　1.2.3 四膜蟲RNA的提取和基因檢測</p><p>　　本實驗使用Trizol RNA提取試劑盒提取四膜蟲總RNA</p><p>　　1.2.3.1 四膜蟲RNA的提取</p><p>　　(1). 四膜蟲離心收集：5000r/min離心20分鐘，去上清后轉(zhuǎn)移至1.5

28、mlEP管中，再次離心，盡量去除殘留的培養(yǎng)液；</p><p>　　(2). 振蕩：將收集好的蟲體，加入1ml Trizol，懸浮收集的細胞團，漩渦振蕩及勻漿；</p><p>　　(3). 分離：將勻漿樣品在室溫下孵育15min，按至少5:1的比例加入氯仿，蓋緊管蓋，充分振蕩混勻并將其在冰上孵育15min，然后于4℃，12000r/min，離心15min。離心后混合物分為三層，RNA存在

29、于上清層中。</p><p>　　(4). RNA的沉淀：將上清層轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，加入等體積冰浴的異丙醇，緩慢顛倒混勻，將樣品在-20℃下孵育20min以上，4℃，12000r/min，離心10min，RNA通常呈片狀沉淀附著于管壁或管底；</p><p>　　(5). RNA的洗滌：棄去上清，用冰浴的75％乙醇洗滌RNA沉淀1~2次，按1ml Trizol至少加入1ml 75％乙醇

30、的比例加入，顛倒洗滌管壁，并漩渦振蕩樣品，盡可能讓沉淀懸浮，4℃，12000r/min，離心5min，棄去上清，晾干沉淀；</p><p>　　(6). RNA的溶解及保存：適度晾干沉淀(避免過分干燥，會降低其可溶性)，用適量無RNA酶水來溶解RNA，抽提好的RNA保存于-70℃，必要時應加入適量抗RNA水解酶。</p><p>　　1.2.3.2 基因的檢測</p><

31、;p>　　(1). one step RT-PCR擴增反應體系如下(表4)：</p><p>　　表4 one step RT-PCR擴增反應體系</p><p>　　反應程序設置如下(表5)：</p><p>　　表5 one step RT-PCR擴增反應程序</p><p>　　(2). ACTIN、MDR1及HSP70基

32、因的檢測</p><p>　　表6 ACTIN、MDR1及HSP70基因的檢測退火溫度及循環(huán)數(shù)</p><p><b>　　1.3 數(shù)據(jù)處理 </b></p><p>　　實驗數(shù)據(jù)運用Excel軟件處理，T檢驗。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>

33、;　　2.1 不同濃度納米TiO2對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力的影響</p><p>　　采用不同濃度納米TiO2處理四膜蟲后對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力的影響(圖1)。結(jié)果表明：與對照組(0 mg·L-1)相比，低濃度組(1 mg·L-1、10 mg·L-1) 乙酰膽堿酯酶活力分別下降了10.96%、11.77%，但是均無顯著差異(差異不顯著，P>0.05)；

34、高濃度組(100 mg·L-1、500 mg·L-1) 乙酰膽堿酯酶活力分別下降了64.88%、72.22%(差異顯著，P<0.05)。</p><p>　　由此可見，納米TiO2顆粒對四膜蟲乙酰膽堿酯酶活力的影響隨著顆粒濃度的提高，其抑制作用越強，且500 mg·L-1濃度的納米TiO2抑制作用最強。</p><p>　　圖1 不同濃度納米TiO2

35、處理后對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力的影響</p><p>　　2.2 不同濃度納米TiO2對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響</p><p>　　采用不同濃度納米TiO2處理四膜蟲后對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響(圖2)。結(jié)果表明：與對照組(0 mg·L-1)相比，四個濃度組的納米TiO2 (1 mg·L-1、10 mg·L-1、100

36、 mg·L-1、500 mg·L-1) 琥珀酸脫氫酶活力分別下降了28.54%、33.92%、42.84%、47.80%，其中1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1這三個濃度的納米TiO2的影響均無顯著差異(差異不顯著，P>0.05)，500 mg·L-1 濃度的納米TiO2對其活力影響有顯著差異(差異顯著，P<0.05)。</p>

37、<p>　　由此可見，四個濃度組的納米TiO2對四膜蟲琥珀酸脫氫酶活力均有抑制作用，且隨著納米TiO2顆粒濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。其中500 mg·L-1濃度的納米TiO2抑制作用最強。</p><p>　　圖2 不同濃度納米TiO2處理后對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響</p><p>　　2.3 不同濃度納米TiO2對四膜蟲MDR1及HSP70基

38、因表達的影響</p><p>　?。?）采用不同濃度納米TiO2處理后四膜蟲ACTIN基因的表的結(jié)果(圖3)。結(jié)果表明，同一處理時間，不同處理濃度下四膜蟲ACTIN基因表達量是較為一樣的。ACTIN基因是管家基因，它在各組織和細胞中的表達相對穩(wěn)定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用來作為參照。此處ACTIN的表達量較為一致，說明，前期的工作滿足后續(xù)的實驗要求。</p><p>　　圖3

39、同一處理時間，不同處理濃度下四膜蟲ACTIN基因RT-PCR結(jié)果</p><p>　?。?）采用不同濃度納米TiO2處理后四膜蟲多藥耐受基因(Multidrug Resistance Gene；MDR1 )的表達結(jié)果(圖4)，用 BioSens Gel Imaging System軟件進行處理分析后得出MDR1相對含量（圖5）：</p><p>　　結(jié)果表明，同一處理時間，不同處理濃度下四

40、膜蟲多藥耐受基因（MDR1）表達量明顯高于對照組，且隨著納米TiO2濃度的升高，MDR1的表達量減少。當用不同濃度的納米TiO2處理四膜蟲后，從1 mg·L-1的納米TiO2濃度起，MDR1的表達量明顯增多，且在100 mg·L-1和500 mg·L-1為顯著性增加，說明隨著納米TiO2濃度的升高四膜蟲開始作出反應，因此，隨著納米TiO2濃度的升高MDR1的表達量逐漸增加。</p><p

41、>　　圖4 同一處理時間，不同處理濃度下四膜蟲MDR1基因RT-PCR結(jié)果</p><p>　　圖5 MDR1相對含量</p><p>　?。?）采用不同濃度納米TiO2處理后四膜蟲熱休克蛋白基因（Heat Shock Protein; HSP70）的表達的結(jié)果(圖6)，用 BioSens Gel Imaging System軟件進行處理分析后得出HSP70相對含量（圖7）：&l

42、t;/p><p>　　結(jié)果表明，納米TiO2處理后HSP70的表達量在1 mg·L-1和10 mg·L-1時較對照組增加，隨著處理濃度的升高HSP70表達量減少。當用不同濃度的納米TiO2處理四膜蟲后，100 mg·L-1和500 mg·L-1的納米TiO2使HSP70的表達量減少，且低于對照組的表達量，說明納米TiO2的濃度在四膜蟲的可承受范圍內(nèi)，隨著納米TiO2濃度的升高四

43、膜蟲開始適應并緩解納米TiO2對其的影響，因此，隨著納米TiO2濃度的升高HSP70的表達量有降低的趨勢。</p><p>　　圖6 同一處理時間，不同處理濃度下四膜蟲HSP70基因RT-PCR結(jié)果</p><p>　　圖7 HSP70相對含量</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　納

44、米技術是當今高科技發(fā)展中最快的領域之一，大約超過200種的納米材料被用于個人、商業(yè)、醫(yī)藥和軍事等領域。目前，全球有超過140家的廠家在從事納米顆粒的生產(chǎn)[26]。納米技術是把雙刃劍，高科技納米材料生產(chǎn)使用可能給人們帶來潛在的健康危害負面影響隨著規(guī)?；a(chǎn)和納米產(chǎn)品的普及，納米材料將進入我們的土壤、空氣和水環(huán)境，進而不可避免地進入生物體內(nèi)[27]。環(huán)境中的生物降解納米粒子可能會導致細胞內(nèi)細胞器積聚納米顆粒，如破壞完整或細胞內(nèi)基因改變的變化

45、[28]。</p><p>　　乙酰膽堿酯酶(TChE)是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶，具有羧肽酶和氨肽酶的活性，乙酰膽堿酯酶參與細胞的發(fā)育和成熟，能促進神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)再生。直接參與植物神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、肌肉運動、大腦思維、記憶等重要功能。膽堿酯酶活力改變時，以上各組織器官功能也會改變。本實驗中，納米TiO2顆粒對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力的影響隨著顆粒濃度的提高，其抑制作用越強；四個濃度組的納米TiO2

46、 (1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1、500 mg·L-1)對四膜蟲乙酰膽堿酯酶(TChE)活力均有抑制作用，且隨著納米TiO2顆粒濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。說明通過納米TiO2的處理，四膜蟲乙酰膽堿酯酶活力降低，隨著納米TiO2濃度的增加，其活力下降得越多。</p><p>　　琥珀酸脫氫酶(SDH)是線粒體的一種標志酶，是連接氧化磷酸化與

47、電子傳遞的樞紐之一。SDH可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，其活性一般可作為評價三羧酸循環(huán)運行程度的指標。琥珀酸脫氫酶存在于所有有氧呼吸細胞，和線粒體膜牢固結(jié)合，是三羧酸循環(huán)中唯一與內(nèi)膜結(jié)合的酶。本實驗中，納米TiO2顆粒對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力的影響隨著顆粒濃度的提高，其抑制作用越強；四個濃度組的納米TiO2 (1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1

48、、500 mg·L-1)對四膜蟲琥珀酸脫氫酶(SDH)活力均有抑制作用，且隨著納米TiO2顆粒濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。說明納米TiO2的處理對四膜蟲琥珀酸脫氫酶活性有影響，且隨著其濃度的增加，酶活力逐漸下降。</p><p>　　多藥耐受基因(MDR1)是一種重要的抗藥物質(zhì)，是在研究中發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤多種自然生物類抗腫瘤發(fā)生交叉耐受的基因。本實驗中，隨著納米TiO2顆粒濃度的增加，MDR1基因

49、的表達逐漸增多，且各個處理組(1 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1、500 mg·L-1)的表達量均高于對照組(0 mg·L-1)，說明四膜蟲在納米TiO2的脅迫下，為了維持機體功能的有序性，對外界環(huán)境作出反應，增強MDR1基因的表達，提高了自身的耐藥性。</p><p>　　熱休克蛋白(hsp70)是指在生物體內(nèi)普遍存在、進化上高度保守、具

50、有重要生理功能的蛋白質(zhì)家族，是生物在應激條件下產(chǎn)生的一種非特異性、能增強機體對創(chuàng)傷、高低溫、以及細菌和病毒感染等適應能力的防御性產(chǎn)物。此外，各種應激因素，如細菌和病毒的感染、溫度的高低、缺氧和缺血等都可誘導細胞產(chǎn)生hsp70。hsp70能促進與維持新生多肽鏈的正確折疊，調(diào)節(jié)細胞的生長、分裂、分化、死亡。本實驗中， HSP70的表達量在開始時呈上升趨勢，后下降。分析其原因， 表達量增加是四膜蟲的應激反應，以增強其對外界環(huán)境的適應能力。但隨

51、著納米TiO2濃度的增大，可能對四膜蟲機體造成了傷害，HSP70表達量下降，進而影響到新生多肽鏈生成，引起蛋白質(zhì)損傷、變性。</p><p>　　在氧化納米顆粒脅迫下，四膜蟲機體可能會發(fā)生反應生物體暫時所處狀態(tài)的兩種應激改變：誘導或抑制，但這些改變并不是最終的毒理效應。抑制效應反映了生物體對環(huán)境壓力十分敏感并可能受到進一步的損傷；而誘導效應則是生物體克服不良環(huán)境和防止中毒的一種適應性改變[29]。</p&g

52、t;<p>　　本研究初步證實氧化納米顆粒TiO2對四膜蟲機體的影響均表現(xiàn)出濃度依賴性。而對其具體的影響機理，還需更進一步的研究。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 白春禮. 納米科技及其發(fā)展前景[J]. 科學通報, 2001, 46(2): 89-92.</p><p>　　[2] 李衛(wèi)華

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