青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因的遺傳轉化研究.pdf

1、α-法尼烯是果實中主要的香氣成分之一，具有許多重要的生物學功能，與昆蟲的誘導性有關。α-法尼烯是誘導虎皮病發(fā)生的重要因素，虎皮病是蘋果、梨在低溫貯藏中后期發(fā)生的最嚴重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，α-法尼烯合成酶是調控α-法尼烯合成的關鍵酶，催化FPP轉變?yōu)棣?法尼烯。 為進一步研究α-法尼烯合成酶的功能，本實驗構建了青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因正義、反義、RNAi表達載體；利

2、用RT-PCR的方法擴增青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因的全長，構建亞細胞定位表達載體，對該酶進行亞細胞定位研究；建立并完善了青香蕉蘋果的高效再生體系和遺傳轉化體系；農桿菌介導法轉化青香蕉蘋果和豐產梨，初步獲得轉基因植株。主要結果如下： 1.構建正義和反義表達載體，并將其轉入農桿菌EHA105。 2.構建α-法尼烯合成酶基因RNAi表達載體，酶切和測序結果表明RNAi目的片段已經(jīng)正確插入到構建的質粒表達載體中。 3

3、.通過克隆青香蕉蘋果的α-法尼烯合成酶基因(AFS)全長，構建PBI-AFS-GFP真核表達載體，農桿菌介導轉化洋蔥表皮細胞，瞬時表達AFS-GFP融合蛋白，首次發(fā)現(xiàn)該酶定位于細胞膜上。 4.以青香蕉蘋果的葉片為材料，進行了不同激素配比及其它影響因子對葉片、根系再生和增殖影響的研究。結果表明：最適宜青香蕉葉片再生不定芽的培養(yǎng)基為MS+BA4.0mg/L+TDZ1.0mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30.0g/L+瓊脂6.0g

4、/L，再生頻率高達100％，最適的暗培養(yǎng)時間為20天，葉片正放在培養(yǎng)基上的再生效果優(yōu)于反放，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+瓊脂6.0g/L，最終建立了青香蕉蘋果葉片高效再生體系。 5.完善了青香蕉蘋果的遺傳轉化體系，確定在再生過程中Kan選擇壓為15mg/L；通過研究不同濃度的頭孢霉素和羧芐青霉素對農桿菌的抑制效果，確定抑菌過程中以頭孢霉素100mg/L+羧芐青霉素100