低溫脅迫下草菇抗氧化應答反應中關鍵酶的表達量變化及活性研究.pdf

1、草菇是一種喜高溫高濕的熱帶，亞熱帶的食用菌，營腐生性生長在一些富含纖維素的有機質上。草菇適宜在高溫下生長，不能耐受低溫。在5℃以下，草菇菌絲內蛋白質降解，迅速的自溶死亡，子實體會軟化，褐變，最后液化腐爛。這種特性給草菇的栽培，儲藏，運輸造成不利影響。因此研究草菇的低溫應答機制對培育，篩選耐低溫的草菇品種具有重要的意義。
　　實驗材料為低溫敏感型草菇菌株V23和較耐低溫的草菇菌株VH3。將兩株草菇菌株的菌絲分別在冰浴條件下處理0，2

2、，4，6，8h，收集菌絲然后進行以下實驗:(1)測定反應細胞受傷害程度的指標—電導率，丙二醛含量以及草菇菌絲的恢復生長時間和菌絲長速，以確定兩株菌株耐低溫能力的差異性;(2)通過RT-PCR技術對抗氧化酶系統(tǒng)中清除活性氧的關鍵酶(Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GR)的基因的表達進行定量分析;(3)對關鍵抗氧化酶(Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GR)的氨基酸序列進行序列比對和進化樹分析，并測定了這些抗氧化酶(SOD

3、，CAT，APX，GR)的活性。
　　實驗結果表明:
　　1、兩株草菇菌株菌絲的電導率變化趨勢一致。在低溫脅迫的0-2h內，電導率上升速度最快，在2-6h內，相對電導率值保持穩(wěn)定，在6-8h又出現(xiàn)上升。在整個低溫脅迫過程中，草菇菌株VH3的相應的電導率值小于V23，說明草菇菌株VH3菌株比V23能夠更好的保持細胞膜的完整性，受到的傷害小。
　　2、低溫脅迫的時間越長，草菇菌絲恢復生長所需的時間就越長，恢復生長的速度就越

4、慢。草菇菌株V23的菌絲恢復生長所需時間比VH3長，并且菌絲長速比VH3慢。低溫脅迫時間越長，菌絲的恢復生長的時間和長速差異就越明顯。
　　3、在低溫脅迫的0-2h中，VH3菌株的丙二醛(MDA)變化不明顯，V23菌株的MDA含量上升。但是在低溫脅迫的2-4h期間，菌株VH3的菌絲中MDA含量上升較快，并在低溫脅迫的4-8h期間，兩株菌株之間的MDA的含量幾乎沒有差異。
　　4、將獲得的草菇的抗氧化酶(Cu/Zn-SOD，M

5、n-SOD，CAT，GR)的氨基酸序列與與其他真菌中確定功能的這些酶的氨基酸序列進行序列比對分析，構建進化樹，結果證實草菇這四種酶的氨基酸序列與真菌相應的酶具有較高的同源性。保證了以這些抗氧化酶的堿基序列為基礎的基因定量的正確性。
　　5、銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因的相對表達量在兩株草菇菌株之間的表達量差異較小，低溫處理期間總體呈先上升后下降的趨勢，在VH3中的相對表達量略高于V23。低溫脅迫下的草菇菌株VH3

6、中錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的基因相對表達量先上升后下降，在草菇菌株V23中表現(xiàn)出相反的趨勢，該基因在VH3中的表達量遠遠高于V23。SOD活性先上升后下降，低溫脅迫0-4h階段，菌株VH3中SOD的活性高于菌株V23，但是后期VH3菌株的SOD活性下降較快。說明VH3菌株比V23菌株能夠耐受低溫可能與SOD的表達有關，尤其是Mn-SOD。
　　6、兩株草菇的過氧化氫酶(CAT)基因的相對表達量都是先下降然后上升的趨勢，但是

7、VH3菌株的CAT基因的相對表達量遠遠高于V23菌株。CAT的活性在低溫脅迫期間總體呈上升的趨勢，而且VH3的CAT活性上升速度高于V23菌株，VH3菌株的CAT能夠更有效的清除H2O2。
　　7、抗壞血酸過氧化物酶(APX)也是清除H2O2的重要的酶。APX的活性在兩株草菇菌株中的活性先上升后下降，菌株之間的APX活性幾乎沒有差異，APX可能不是兩株菌株低溫耐受性差異的原因。
　　8、低溫脅迫期間，GR基因的相對表達量呈先