我國葡萄卷葉病病原病毒的分子鑒定.pdf

1、葡萄卷葉?。℅LD）是葡萄上危害最重要的病毒病害之一，在全世界各葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。引起該病害的病原復(fù)雜，目前已鑒定的葡萄卷葉相關(guān)病毒（GLRaVs）有11種（GLRaV 1～11）。分類上為長線病毒科（Closteroviridae），其中GLRaV-1，-3，-4，-5，-6，-8和-9屬于葡萄卷葉病毒屬（Ampelovirus），GLRaV-2屬于長線病毒屬（Closterovirus），GLRaV-7尚未歸屬。僅發(fā)現(xiàn)GLRaV-1

2、、GLRaV-2和GLRaV-3可通過自然介體傳播。
　　 本研究采用ELISA技術(shù)對2008年從鄭州果樹所葡萄種質(zhì)資源圃采集的表現(xiàn)卷葉癥狀的28份葡萄品種的5種GLRaVs進(jìn)行檢測，其中GLRaV-1發(fā)生最普遍，其檢出率分別達(dá)35.7％；其次為GLRaV-3，檢出率為25％；GLRaV-6和GLRaV-7的檢出率分別為14.3％和17.9％；GLRaV-2檢出率相對較低，為7.1％，且多種GLRaVs復(fù)合感染的現(xiàn)象普遍。

3、>　　 以85份帶有卷葉癥狀的樣品為材料，刮取韌皮部組織提取病毒dsRNA，以dsRNA為模板，采用根據(jù)GLRaVs的HSP70基因保守序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)R7HSP70L/LR7HSP70R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，從14份葡萄樣品中獲得了預(yù)期大小約590bp的目標(biāo)片段，經(jīng)克隆和測序，將得到的核苷酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析及核苷酸同源性比較，結(jié)果表明所獲擴(kuò)增產(chǎn)物分別為GLRaV-1、GLRaV-3和GLRaV-7三種病毒

4、的HSP70基因片段。其中GLRaV-1和GLRaV-3擴(kuò)增片段大小為602bp；GLRaV-7擴(kuò)增片段大小為590bp。
　　 通過對隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行PCR－SSCP分析，發(fā)現(xiàn)來自樣品‘白雅’的16個(gè)克隆產(chǎn)生4種SSCP帶型；來自樣品‘阿芳’的10個(gè)克隆產(chǎn)生2種SSCP帶型。選取表現(xiàn)不同帶型的克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示來自‘白雅’的擴(kuò)增產(chǎn)物為GLRaV-1，GLRaV-3和GLRaV-7的HSP70混合物；來自樣品‘阿芳’的擴(kuò)增產(chǎn)