水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體PHT1家族翻譯后調(diào)控的分子機(jī)制研究.pdf

1、水稻是中國(guó)及亞洲諸國(guó)最為重要的糧食作物之一。目前水稻生產(chǎn)中由于磷肥低效，而過(guò)度使用磷肥既增加生產(chǎn)成本，也使環(huán)境受到污染。因此培育磷高效的作物對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。磷肥的利用效率是由植物對(duì)磷元素的吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)與生理利用的協(xié)同調(diào)控所決定的，而在此過(guò)程中具有重要功能的因子有磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(PTs)和其他與磷轉(zhuǎn)運(yùn)及生理利用相關(guān)的調(diào)控蛋白。PTs在質(zhì)膜上執(zhí)行的功能受到來(lái)自轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。近年來(lái)研究表明，PHF1（磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)

2、運(yùn)協(xié)助因子1）是調(diào)控?cái)M南芥中高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體PHT1;1的一個(gè)關(guān)鍵因子，同時(shí)PHT1;1蛋白羧基末端的第514位的絲氨酸受到的磷酸化調(diào)控影響該轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。
　　 在本研究中，我們通過(guò)在30μM的砷酸鈉(Na3AsO4·H2O)溶液水培條件下篩選水稻（粳稻日本晴）的EMS（甲基磺酸乙酯）誘變突變體庫(kù)，克隆了水稻中PHF1的同源基因OsPHF1(LOC_Os07g0900)，并通過(guò)突變體分子鑒定及轉(zhuǎn)基因水稻研究工

3、作定義其功能。在三個(gè)圖位克隆所確定的phf1等位突變體中，兩個(gè)突變位置都在跨膜結(jié)構(gòu)域上，而另外一個(gè)點(diǎn)突變產(chǎn)生于第五個(gè)WD40折疊基序上。這些等位突變體都具有抗砷的表型且磷吸收能力顯著降低。突變體研究表明PHF1的氨基末端親水WD40結(jié)構(gòu)域和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于其功能都十分重要。研究結(jié)果表明，OsPHF1蛋白的突變將導(dǎo)致低親和轉(zhuǎn)運(yùn)體OsPT2(LOC_Os03g05640)及高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體OsPT8(LOC_Os10g30790)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留。

4、因?yàn)榈?14位絲氨酸在擬南芥和水稻的PHT1家族中都十分保守，因此OsPHF1對(duì)OsPT2/8從ER逃逸的協(xié)助作用可能在其他的PT蛋白調(diào)控過(guò)程中也是保守的。Osphf1突變還能夠降低由于OsPHR2超表達(dá)而導(dǎo)致的植株地上部有效磷的過(guò)度積累。OsPHF1超表達(dá)使得正常磷水培條件下植株根，葉中的有效磷超積累。上述結(jié)果表明OsPHF1在水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族向質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中的重大作用，從而影響水稻對(duì)有效磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。PHF1蛋白協(xié)助PH

5、T1蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控在擬南芥和水稻中十分保守，這使得我們可以利用序列比對(duì)的生物信息學(xué)方法，將擬南芥中的研究成果擴(kuò)展到作物研究領(lǐng)域中。
　　 我們?cè)谶M(jìn)一步的研究中通過(guò)篩選水稻根部的cDNA文庫(kù)找到了OsPT8的互作因子-蛋白激酶OsCK2的組成因子CK2β3(LOC_Os07g02350)。CK2是真核生物中一個(gè)非常保守的絲氨酸/蘇氨酸磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，水稻中組成OsCK2的四個(gè)亞基業(yè)已報(bào)道，它們是:CK2α2(LOC_

6、Os07g02350),CK2α3(LOC_Os03g10940),CK2β1(LOC_Os10g41250),CK21β3(LOC_Os07g31280)。體外和體內(nèi)的試驗(yàn)表明CK2β3可與OsPT2/8直接互作，并且CK2β3對(duì)于CK2α3和OsPT的磷酸化是必需的。原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因植株觀察發(fā)現(xiàn)CK2α3/β3的超表達(dá)會(huì)引起OsPT蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留。CK2α3/β3超表達(dá)和RNA干涉株系都會(huì)使轉(zhuǎn)基因植株磷吸收能力發(fā)生紊亂

7、，為全酶（由催化亞基α3和調(diào)控亞基β3組成）的生物學(xué)功能提供了遺傳學(xué)證明。
　　 CK2α3/β3的亞細(xì)胞定位表明兩個(gè)亞基都在細(xì)胞核中和細(xì)胞質(zhì)中定位，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，順式高爾基體標(biāo)記熒光蛋白共轉(zhuǎn)化結(jié)果表明兩個(gè)亞基都存在于早期的內(nèi)膜運(yùn)輸途徑中。體外磷酸化試驗(yàn)表明CK2β3不具有磷酸化OsPT8親水羧基末端(OsPT8C-terminalDomain，PT8CTD)的能力，而CK2α3可作為全酶發(fā)揮功能。同時(shí)對(duì)PT8CTD上三個(gè)潛在的CK2

8、磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變研究證實(shí)了PT8CTD上只有第517位的絲氨酸是CK2的磷酸化位點(diǎn)。植物蛋白的體內(nèi)磷酸化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步為該結(jié)論提供了證明。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明OsPHF1不與磷酸化OsPT8(PTS517D)結(jié)合。利用CK2α3介導(dǎo)的體外磷酸化修飾的PT8CTD與OsPHF1之間的相互作用，我們進(jìn)一步提供了體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。與之相對(duì)應(yīng)的，超表達(dá)CK2α3/β3無(wú)法改變模擬非磷酸化的OsPT蛋白的質(zhì)膜定位現(xiàn)象，并且CK2α3/β

9、3敲除也無(wú)法回復(fù)phfⅠ突變體的磷吸收能力。因此我們推測(cè)植物中的PT蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的逃逸過(guò)程同時(shí)受到了PHF1和CK2的調(diào)控:PHF1與非磷酸化狀態(tài)的PT蛋白結(jié)合并協(xié)助其離開(kāi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，運(yùn)往質(zhì)膜;而CK2能夠使PT蛋白磷酸化并阻礙其與PHF1的互作。除此以外，對(duì)植株的磷酸化分析表明，缺磷顯著降低了CK2α3/β3介導(dǎo)的PT磷酸化。這至少由兩個(gè)方面決定:(1)PHF1在缺磷條件下蛋白積累，從而增強(qiáng)PT向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn);(2)CK2β3在缺磷條件下磷酸