大菱鲆紅體病虹彩病毒基因組全序列測定和分析及其在海水養(yǎng)殖魚類中無癥狀感染的PCR分析.pdf

1、虹彩病毒(iridovirus)是一類感染變溫脊椎動物和無脊椎動物的二十面體狀、大型細(xì)胞質(zhì)DNA病毒，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物和野生動物重要的病毒性病原。大菱鲆紅體病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是新發(fā)現(xiàn)的感染中國和韓國養(yǎng)殖大菱鲆的魚類虹彩病毒，是工廠化養(yǎng)殖大菱鲆最主要的病毒性病原之一。本文應(yīng)用PCR擴(kuò)增、DNA克隆、大規(guī)模測序與生物信息學(xué)等方法，測定并分析了TRBIV的全基因組序列。結(jié)果顯示

2、，TRBIV基因組為雙鏈線狀DNA，全長為110，104 bp，G+C含量為54.99％。全基因組中含有115個(gè)可能的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼長度介于40到1168個(gè)氨基酸殘基的多肽。全部ORF覆蓋了TRBIV基因組92％的區(qū)域，其中56.5％為正向編碼，43.5％為反向編碼。TRBIV的115個(gè)ORFs中有39個(gè)ORFs與傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidne

3、y necrosis virus，ISKNV)、條石鯛虹彩病毒(rock bream iridovirus，RBIV)、褐點(diǎn)石斑魚虹彩病毒(Orange-spotted grouperiridovirus，OSGIV)的已知功能的ORF有高度的相似性，相似度分別為76-99％，87-99％，75-99％。這些蛋白大致可以分為以下幾類：DNA復(fù)制相關(guān)，轉(zhuǎn)錄和核酸代謝相關(guān)，蛋白修飾相關(guān)，宿主相關(guān)，膜相關(guān)等等。TRBIV基因組中散布著許多重復(fù)

4、序列，包括正向重復(fù)序列、反向重復(fù)序列和回文序列，其中絕大部分為正向重復(fù)，并與ISKNV、真鯛虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)、OSGIV的重復(fù)序列高度相似。采用TRBIV的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白如主要衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)、腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatease，ATPase)、DNA聚合酶(DNApolymerase，DdDp)、核苷酸還

5、原酶小亞基(ribonucleotide reductase，small chain，RNRS)，胞嘧啶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Cytosine-C5-specific DNA methylase，DMet)的氨基酸序列構(gòu)建了虹彩病毒系統(tǒng)進(jìn)化樹，在分子水平上研究了TRBIV的系統(tǒng)進(jìn)化，結(jié)果表明TRBIV屬于虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬。TRBIV全基因組序列的測定為診斷和防治水產(chǎn)動物虹彩病毒病提供分子生物學(xué)的基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物虹彩

6、病毒病的防治開辟途徑。 將TRBIV全基因組序列分別與腫大細(xì)胞虹彩病毒屬中的ISKNV，OSGIV，RBIV的核苷酸序列進(jìn)行比對，尋找TRBIV與它們在序列上的差異區(qū)，差異區(qū)即為腫大細(xì)胞虹彩病毒屬內(nèi)不同株型之間的變異區(qū)，即TRBIV最可能的潛在的變異區(qū)。選取差異較大的5處變異區(qū)，在變異區(qū)的兩端設(shè)計(jì)正反引物對4株不同地方不同年代的TRBIV進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測序結(jié)果表明4株不同地方不同年代的TRBIV在這5處地方不存在任何差異。

7、 研究建立了一種檢測TRBIV的套式PCR方法，用該方法對不同稀釋倍數(shù)的重組質(zhì)粒pMD18-TRBIV ATPase為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示所建立的套式PCR的靈敏度大約為一步PCR的104倍。用建立的套式PCR方法對我國常見海水養(yǎng)殖魚類進(jìn)行TRBIV流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)一步PCR檢測為陰性的寬體舌鰨，半滑舌鰨，黑裙，非洲石斑魚等4種魚類，經(jīng)套式PCR擴(kuò)增出長度為471bp的特異性的DNA片段，將該片段PCR產(chǎn)物測序。用NCBI