三個(gè)品種豬腸道β-防御素表達(dá)與特性分析.pdf

1、防御素作為哺乳動(dòng)物先天性免疫和獲得性免疫的重要組成部分,具有抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)、作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn),成為生物學(xué)科領(lǐng)域當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。豬β-防御素在粘膜上皮細(xì)胞和白細(xì)胞中大量分布,是機(jī)體抵抗外界病原微生物的首次屏障,是先天性免疫的重要因子。
　　為了探索不同品種豬之間腸道防御素表達(dá)水平與定位檢測(cè),本研究以皖南花豬、皖南黑豬、雜交豬為研究對(duì)象,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同品種豬之間腸道β-防御素表達(dá),利用原位雜交技術(shù)進(jìn)行β-防

2、御素在腸道內(nèi)的原位表達(dá)檢測(cè),成功從皖南黑豬腸道粘膜內(nèi)分離純化出具有抑菌活性的抗菌肽。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、豬不同腸段β-防御素的表達(dá)水平比較
　　根據(jù)GenBank中登記的豬β防御素(pBD-1、pBD-2、pBD-3)序列設(shè)計(jì)保守序列特異性引物,從小腸中提取總RNA,采用一步法反轉(zhuǎn)錄后,測(cè)序比對(duì),并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)比較不同腸段防御素的表達(dá)。結(jié)果表明:皖南黑豬、皖南黑豬β-防御素序列保守。在3個(gè)腸段

3、中,回腸中β-防御素基因表達(dá)量最高,在品種間表達(dá)差異上,皖南黑豬β-防御素在小腸上表達(dá)量極顯著高于雜交豬和皖南花豬(p<0.01)。說明β-防御素在品種間存在一定的差異性。
　　2、豬腸道β-防御素的原位表達(dá)
　　選取具有表達(dá)類型代表性的pBD-1和pBD-2,設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,采用SABC-FITC熒光標(biāo)記,檢測(cè)β-防御素在豬腸道中的原位表達(dá)。結(jié)果表明:pBD-1mRNA在粘膜上皮和粘膜下層有雜交信號(hào),而pBD-2mRNA

4、表達(dá)在粘膜下層和固有層有雜交信號(hào)。
　　3、豬小腸抗菌肽的分離純化和抑菌實(shí)驗(yàn)
　　采用冰醋酸浸提法、離子交換層析技術(shù)對(duì)皖南黑豬小腸粘膜抗菌肽提取物進(jìn)行分離提取純化,應(yīng)用瓊脂糖彌散法對(duì)抗菌肽提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),使用Tricine-SDS-PAGE電泳對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行分子量測(cè)定,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)純化物的蛋白濃度。結(jié)果表明:所得的高純度抗菌肽對(duì)大腸埃希菌和豬腸道分離沙門氏菌有較高的抑菌作用,測(cè)定蛋白濃度為0.15mg/mL。