三個品種豬腸道β-防御素表達與特性分析.pdf

1、防御素作為哺乳動物先天性免疫和獲得性免疫的重要組成部分,具有抗菌譜廣、抗菌能力強、作用機制獨特等特點,成為生物學(xué)科領(lǐng)域當(dāng)前研究的熱點。豬β-防御素在粘膜上皮細胞和白細胞中大量分布,是機體抵抗外界病原微生物的首次屏障,是先天性免疫的重要因子。
　　為了探索不同品種豬之間腸道防御素表達水平與定位檢測,本研究以皖南花豬、皖南黑豬、雜交豬為研究對象,應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同品種豬之間腸道β-防御素表達,利用原位雜交技術(shù)進行β-防

2、御素在腸道內(nèi)的原位表達檢測,成功從皖南黑豬腸道粘膜內(nèi)分離純化出具有抑菌活性的抗菌肽。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、豬不同腸段β-防御素的表達水平比較
　　根據(jù)GenBank中登記的豬β防御素(pBD-1、pBD-2、pBD-3)序列設(shè)計保守序列特異性引物,從小腸中提取總RNA,采用一步法反轉(zhuǎn)錄后,測序比對,并應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測比較不同腸段防御素的表達。結(jié)果表明:皖南黑豬、皖南黑豬β-防御素序列保守。在3個腸段

3、中,回腸中β-防御素基因表達量最高,在品種間表達差異上,皖南黑豬β-防御素在小腸上表達量極顯著高于雜交豬和皖南花豬(p<0.01)。說明β-防御素在品種間存在一定的差異性。
　　2、豬腸道β-防御素的原位表達
　　選取具有表達類型代表性的pBD-1和pBD-2,設(shè)計寡核苷酸探針,采用SABC-FITC熒光標記,檢測β-防御素在豬腸道中的原位表達。結(jié)果表明:pBD-1mRNA在粘膜上皮和粘膜下層有雜交信號,而pBD-2mRNA

4、表達在粘膜下層和固有層有雜交信號。
　　3、豬小腸抗菌肽的分離純化和抑菌實驗
　　采用冰醋酸浸提法、離子交換層析技術(shù)對皖南黑豬小腸粘膜抗菌肽提取物進行分離提取純化,應(yīng)用瓊脂糖彌散法對抗菌肽提取物進行抑菌實驗,使用Tricine-SDS-PAGE電泳對純化產(chǎn)物進行分子量測定,通過標準曲線法檢測純化物的蛋白濃度。結(jié)果表明:所得的高純度抗菌肽對大腸埃希菌和豬腸道分離沙門氏菌有較高的抑菌作用,測定蛋白濃度為0.15mg/mL。