小麥谷氨酰胺合成酶在氮素代謝中的功能分析.pdf

1、作物的氮素吸收、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)以及氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸等含氮有機(jī)物合成是伴隨作物生長(zhǎng)發(fā)育的、與氮素利用密切相關(guān)的重要的氮素代謝過程。前人利用基因突變與過表達(dá)、QTL定位和植物生理學(xué)的方法證明谷氨酰胺合成酶(GS)及其活性與氮素利用及產(chǎn)量性狀顯著正相關(guān)；利用免疫組化、層析以及western-blot等細(xì)胞與生物化學(xué)技術(shù)闡明GS2定位于葉綠體及線粒體中，與氮素的同化相關(guān)；GS1定位于維管束組織的細(xì)胞液中，與氮素轉(zhuǎn)移再利用相關(guān)，但在酶水平上尚未闡

2、明不同的胞液GS同工酶在氮素代謝中的作用。我們利用native-PAGE結(jié)合活性染色技術(shù)首次從小麥中分離了4種遷移率和活性不同的GS同工酶，遷移率從大到小依次為GS2、GSx1、GSx2和GS1。需要對(duì)GS同工酶的亞基組成、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行鑒定，并從小麥生長(zhǎng)發(fā)育的角度解析其在氮素吸收、同化及在轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　 利用差速離心和密度離心技術(shù)純化了小麥葉片的葉綠體和線粒體，native-PAGE結(jié)合活性染色及western b

3、lot研究表明遷移率最大、活性最高的GS2僅存在于葉綠體內(nèi)，由45kD的亞基組成，是質(zhì)體型GS。初步判定GSx1、GSx2和GS1存在于細(xì)胞液中。從Native-PAGE分別回收GS同工酶，利用western blot鑒定GS同工酶的亞基組成，結(jié)果表明GS1由38kD的亞基組成，是胞液型GS；GSx1由45kD的亞基組成，GSx2由38kD的亞基和45kD的亞基組成。
　　 依據(jù)western blot結(jié)果，利用MALDI-TO

4、F-MS/MS對(duì)2-D膠中蛋白大小為45kD，pH為4.7-5.9范圍內(nèi)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示為質(zhì)體型GS，在38kD附近沒有鑒定到胞液型GS，可能因?yàn)镚S1蛋白的相對(duì)豐度較低。利用Native-PAGE結(jié)合SDS-PAGE分離純化了38kD亞基，并采用LC-MS/MS方法對(duì)GS蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示GSx1的蛋白序列和質(zhì)體型GS2一致，GS1中的鑒定中出現(xiàn)了GS1、GSr1和GSr2三種蛋白小麥GS同工酶時(shí)空表達(dá)研究表明，在莖中

5、，GS1活性在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期均處于主導(dǎo)地位，GS2，GSx1、GSx2僅在綠色莖中有較弱的表達(dá)；莖中含有豐富的維管束，主要起運(yùn)輸作用，進(jìn)一步證明GS1與氮素轉(zhuǎn)移有關(guān)。在葉片中，GS2活性在功能葉中處于主導(dǎo)地位，隨著植株的衰老逐漸減弱直至消失。功能葉光合作用旺盛，葉綠體是光合作用和。NO3-還原的場(chǎng)所，為氮素同化提供原料和能量，也證明GS2參與氮素同化。GS1在葉片的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期均有較弱的活性，可能因葉片光合組織比輸導(dǎo)組織發(fā)達(dá)之故。G

6、S1將功能葉同化氮素向生長(zhǎng)發(fā)育的器官運(yùn)輸，也將衰老葉片中含氮化合物降解釋放的氨重新同化為谷氨酰胺再轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒等庫(kù)器官中。GSx1僅存在于功能盛期的葉片中但活性很高，如開花期至花后14天的旗葉，功能盛期葉片光呼吸作用旺盛，推測(cè)其參與光呼吸釋放氨的同化利用。GSx2僅存在于花后7天的葉片中且活性很弱，尚無法推測(cè)其功能。籽粒中只有GS1活性，在籽粒形成期活性很高，隨后減弱；但其亞基組成卻與莖葉中差異很大。開花后7d的籽粒GS1只有39kD大小