三角帆蚌3個(gè)免疫基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究采用RACE技術(shù)，克隆得到三角帆蚌(Hypriopsis cumingii)金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)基因、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)基因和鐵蛋白(Ferritin，F(xiàn)n)基因等3個(gè)功能基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)這3個(gè)基因的cDNA序列和推導(dǎo)得到的氨基酸序列進(jìn)行分析。同時(shí)，對(duì)這3個(gè)基因在三角帆蚌外套膜、血液、肝、腎、胃、腸、鰓、斧足等8個(gè)組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的表達(dá)研究。為研究這3個(gè)功能基

2、因，還克隆得到內(nèi)標(biāo)β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因的全長(zhǎng)cDNA序列以及進(jìn)行cDNA序列和氨基酸序列的分析，并用半定量PCR檢測(cè)其在以上8個(gè)組織的表達(dá)穩(wěn)定性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1)三角帆蚌β-actin基因
　　 β-actin的cDNA序列全長(zhǎng)為1483bp，由長(zhǎng)92bp的5’非翻譯區(qū)(Untranslated Region，UTR)，257bp的3'UTR，和1134bp的開(kāi)放閱讀框（Open Readin

3、g Frame，ORF）組成。閱讀框共編碼377個(gè)氨基酸，推算的分子量約為41.9ku，理論等電點(diǎn)為5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178，Ser305，Ser321，Pro325，Va1331，Pro346等6個(gè)氨基酸殘基具有特異性，此外還發(fā)現(xiàn)3個(gè)特殊的氨基酸殘基位點(diǎn)以及2個(gè)軟體動(dòng)物特有的氨基酸殘基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列與軟體動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、脊椎動(dòng)物的相似性高達(dá)98-99％。NJ法系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示三角帆蚌首

4、先與軟體動(dòng)物聚在一起，然后與節(jié)肢動(dòng)物聚在一起，再依次與魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、哺乳類(lèi)聚在一起。RT-PCR顯示β-actin基因在外套膜、血液、肝、腎、胃、腸、鰓、斧足共8個(gè)組織的表達(dá)基本一致，具有良好的穩(wěn)定性。
　　 1)三角帆蚌MT基因
　　 MT基因的全長(zhǎng)cDNA序列為467bp，由長(zhǎng)92bp的5'UTR，159bp的3'UTR，和216bp的開(kāi)放閱讀框組成。共編碼71個(gè)氨基酸，分子量大約為7.1ku，理論等電點(diǎn)為7.24。

5、該蛋白序列中半胱氨酸(29.6％)含量最豐富，其次是甘氨酸(14.1％)，存在軟體動(dòng)物MT的特征序列CKCXXXCXCX，且C-末端的氨基酸序列也符合軟體動(dòng)物MT標(biāo)簽序列C-X-C-X(3)-CT-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K。蛋白序列特征分析表明，該序列與其他貝類(lèi)的MT氨基酸具有很高的相似性，具備MT的典型特征，是MT家族的成員。
　　 2)三角帆蚌CAT基因
　　 CAT基因的cDNA序列全長(zhǎng)為

6、2804bp，由長(zhǎng)112bp的5'UTR，1303bp的3'UTR，和1388bp的開(kāi)放閱讀框組成。閱讀框共編碼462個(gè)氨基酸，推算的分子量約為52.7ku，理論等電點(diǎn)為6.35。多序列比對(duì)結(jié)果顯示有一段CAT氨基酸高度保守的催化位點(diǎn)序23FDRERIPERVVHAKGAG39，其中Asn24是軟體動(dòng)物特有的氨基酸殘基（太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）除外），太平洋牡蠣有特殊的氨基酸殘基Gly38;有12個(gè)與還原型輔酶Ⅱ

7、(NADPH)結(jié)合的氨基酸殘基，分別是：Asp107、His153、Phe157、Ser160、Arg162、Asn172、Try174、Lys196、Va1261、Trp262、His264和Try317，其中第261位和第264位的氨基酸在不同物種間有所區(qū)別。比對(duì)結(jié)果得到三角帆蚌CAT氨基酸序列與軟體動(dòng)物的相似性高達(dá)99％，與蝦類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、哺乳類(lèi)的相似性也達(dá)到98-99％，且預(yù)測(cè)為CAT3。NJ法系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示三角帆蚌首先與

8、軟體動(dòng)物聚在一起，再與蝦類(lèi)聚在一起，然后依次與魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和哺乳類(lèi)聚在一起。
　　 3)三角帆蚌Fn基因
　　 Fn基因的cDNA序列全長(zhǎng)為834bp，由長(zhǎng)114bp的5'UTR，195bp的3'UTR，和522bp的開(kāi)放閱讀框組成。閱讀框共編碼174個(gè)氨基酸，推算的分子量約為20.2ku，理論等電點(diǎn)為5.28。Fn基因cDNA的5’端有一段序列為鐵調(diào)控元件“CTTTGCTGCGTCAGTGAACGTACGAGCA”。在

9、氨基酸配體中，還發(fā)現(xiàn)了7個(gè)在所有軟體動(dòng)物中都具保守性亞鐵氧化酶活性位點(diǎn)，它們分別是：Glu25，Tyr30，Glu59，Glu60，His63，Glu105和Gln139。BlastP檢索顯示與紅鮑(Haliotis rufescens)、皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus discus)、紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）、太平洋牡蠣、泥蚶(Tegillarca granosa)、縊蟶（Sinonova

10、cula constricta）等軟體動(dòng)物的相似性均在95％以上，與櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的相似性較低，為89％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示可分為兩大支：鮑類(lèi)與扇貝類(lèi)聚在一起，再與泥蚶為一支；三角帆蚌先與縊蟶聚在一起，再與貽貝、牡蠣聚在一起。
　　 4)熒光定量
　　 MT基因、CAT基因及Fn基因在三角帆蚌的外套膜、血液、肝、腎、胃、腸、鰓、斧足共8個(gè)組織均有表達(dá)。在嗜水氣單胞菌的誘導(dǎo)下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR