豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定（bjs 201703）

1、<p><b>　　附件3</b></p><p>　　豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定</p><p>　　BJS 201703</p><p><b>　　范圍</b></p><p>　　本方法規(guī)定了豆芽中11種植物生長調(diào)節(jié)劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。</p><

2、;p>　　本方法適用于豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和噻苯隆的檢測。</p><p><b>　　原理</b></p><p>　　試樣經(jīng)含1%甲酸的乙腈溶液勻漿提取，脫水，離心后，上清液經(jīng)分散固相萃取凈化，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，外標法定量。</p

3、><p><b>　　試劑和材料</b></p><p>　　除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。</p><p><b>　　試劑</b></p><p><b>　　甲醇：色譜純。</b></p><p>&l

4、t;b>　　乙腈：色譜純。</b></p><p><b>　　甲酸：色譜純。</b></p><p><b>　　乙酸銨：色譜純。</b></p><p><b>　　無水硫酸鎂。</b></p><p><b>　　無水乙酸鈉。</b>

5、;</p><p>　　十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）：粒徑范圍為40 μm—60 μm。</p><p><b>　　試劑配制</b></p><p>　　含1%甲酸的乙腈溶液：量取10 mL甲酸，加乙腈稀釋至1000 mL，混勻。</p><p>　　含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.3854 g

6、乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。</p><p><b>　　標準品</b></p><p>　　6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆標準品，純度均≥90%。標準品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量詳見附錄A中的表A.

7、1。</p><p><b>　　標準溶液的配制</b></p><p>　　植物生長調(diào)節(jié)劑標準儲備液（1 mg/mL）：精密稱取6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆標準品（3.3）各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度各為1 m

8、g/mL標準貯備液，-20℃保存。</p><p>　　混合標準中間液A（10 μg/mL）：分別精密量取11種植物生長調(diào)節(jié)劑標準儲備液 （1 mg/mL） （3.4.1）各1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為10 μg/mL的混合標準中間液A。</p><p>　　混合標準中間液B（1 μg/mL）：精密量取混合標準中間液A（10 μg/mL）（3

9、.4.2）1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1 μg/mL的混合標準中間液B。</p><p>　　空白基質(zhì)提取液：稱取空白試樣各10.0 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL具塞離心管中，自“加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液”起與樣品同法處理（6.1和6.2），作為空白基質(zhì)提取液。</p><p>　　基質(zhì)混合標準工作溶液：分別精密量取混合標

10、準中間液B（1 μg/mL）（3.4.3）0 μL、10 μL、20 μL和40 μL，及混合標準中間液A（10 μg/mL）（3.4.2）10 μL、15 μL和20 μL，用空白基質(zhì)提取液（3.4.4）定容至1.0 mL，作為基質(zhì)混合標準工作溶液S0、S1—S6。濃度依次為0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，或依需要配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標

11、準工作溶液。臨用新制。</p><p><b>　　儀器和設(shè)備</b></p><p>　　高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源）。</p><p><b>　　渦旋混合器。</b></p><p>　　離心機：轉(zhuǎn)速 ≥10000 r/min。</p><p>

12、;　　電子天平：感量分別為0.01 mg和0.01 g。</p><p><b>　　氮吹濃縮儀。</b></p><p><b>　　高速勻漿機。</b></p><p>　　具塞離心管：50 mL和15 mL。</p><p>　　QuEChERS 離心管：內(nèi)含300 mg無水硫酸鎂和100 m

13、g C18。</p><p>　　微孔濾膜：孔徑為0.22 µm有機相型微孔濾膜。</p><p><b>　　試樣制備與保存</b></p><p>　　將豆芽切碎后用組織粉碎機充分粉碎混勻，均分成兩份，作為試樣和留樣，分別裝入潔凈容器中，密封并標記，于-18℃保存。</p><p><b>　　測

14、定步驟</b></p><p><b>　　提取</b></p><p>　　準確稱取 10.0 g（精確至0.01 g）試樣置于 50 mL 具塞離心管（4.7）中，加入 20 mL 含1%甲酸的乙腈溶液（3.2.1），高速勻漿 2 min，加入 4 g 無水硫酸鎂（3.1.5）和 1 g 無水乙酸鈉（3.1.6），立即渦旋混合 1 min，以 1000

15、0 r/min 離心 5 min使乙腈和水相分層。</p><p><b>　　凈化</b></p><p>　　精密量取上層乙腈溶液 4 mL 置于 QuEChERS 離心管（含 300 mg 無水硫酸鎂和 100 mg C18）（4.8）中，渦旋混合 2 min，以 14000 r/min 離心 5 min，移取全部上清液于 15 mL 離心管（4.7）中，于 4

16、5 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至 1 mL，渦旋混勻 1 min，以 14000 r/min 離心 5 min，上清液經(jīng) 0.22 µm 有機相濾膜（4.9）過濾后，取續(xù)濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。</p><p><b>　　色譜測定</b></p><p>　　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測</p><p><b>　

17、　液相色譜條件</b></p><p>　　a) 色譜柱：C18柱，100 mm× 3.0 mm，粒徑 2.7 µm，或性能相當(dāng)者。</p><p>　　b) 流動相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液（3.2.2），B為甲醇。梯度洗脫程序見表1。</p><p>　　c) 流速：300 μL/min。</p>

18、<p>　　d) 柱溫：35 ℃。</p><p>　　e) 進樣量：5 μL。</p><p><b>　　表1 梯度洗脫程序</b></p><p><b>　　質(zhì)譜條件</b></p><p>　　a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）。</p><p>

19、　　b) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。</p><p>　　c) 掃描方式：6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、噻苯隆采用負離子模式掃描；吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑采用正離子模式掃描。</p><p>　　d) 霧化氣（GS1）、氣簾氣（CUR）、輔助氣（GS2）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣或其他合適氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相

20、應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求，參考條件詳見附錄B。</p><p>　　e) 電噴霧電壓（IS）、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）、碰撞室出口電壓（CXP）等參數(shù)使用前應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B中的表B.1和B.2。</p><p><b>　　標準工作曲線制作 </b></p><p&g

21、t;　　將基質(zhì)混合標準工作溶液（3.4.5）按儀器參考條件（6.3.1）進行測定。以基質(zhì)混合標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。</p><p><b>　　定性測定</b></p><p>　　在相同試驗條件下測定試樣和基質(zhì)混合標準工作溶液，記錄試樣和標準工作溶液中植物生長調(diào)節(jié)劑的色譜保留時間，以相對于最強離子豐度的百分比作為定性離子的相對

22、離子豐度。若試樣中檢出與基質(zhì)混合標準溶液（3.4.5）中植物生長調(diào)節(jié)劑保留時間一致的色譜峰，且其定性離子與濃度相當(dāng)?shù)臉藴嗜芤褐邢鄳?yīng)的定性離子的相對豐度相比，偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可以確定試樣中檢出相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)劑。</p><p>　　表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差</p><p><b>　　定量測定</b></p><p&g

23、t;　　若試樣檢出與基質(zhì)混合標準工作溶液一致的植物生長調(diào)節(jié)劑，根據(jù)標準工作曲線按外標法以峰面積計算得到其含量。</p><p>　　空白樣品加標試樣參考色譜圖見附錄 C 中的圖 C.1。</p><p><b>　　空白試驗</b></p><p>　　除不加試樣外，均按試樣同法操作。</p><p><b>

24、　　結(jié)果計算</b></p><p>　　結(jié)果按式（1）計算：</p><p>　　………………………………………….(1)</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　X — 試樣中各待測組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；</p><p>　　c — 從

25、標準工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；</p><p>　　V — 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；</p><p>　　f — 試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)，本方法中為5；</p><p>　　m — 稱樣量，單位為克（g）。</p><p>　　計算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果

26、的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。</p><p>　　檢測方法的靈敏度、準確度、精密度</p><p><b>　　靈敏度</b></p><p>　　本方法中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆檢出限均為5 µg/kg；定量限均

27、為10 µg/kg。</p><p><b>　　準確度</b></p><p>　　本方法在10—100 µg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為60%—120%。</p><p><b>　　精密度</b></p><p>　　在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過

28、算術(shù)平均值的20%。</p><p><b>　　附錄A</b></p><p>　　11種植物生長調(diào)節(jié)劑的化合物相關(guān)信息</p><p>　　表A.1 11種化合物的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量</p><p><b>　　附錄B </b></p>&

29、lt;p><b>　　參考質(zhì)譜條件</b></p><p>　　1）負離子模式掃描質(zhì)譜條件</p><p>　　離子源：電噴霧離子源（ESI源）；</p><p>　　檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；</p><p>　　電噴霧電壓（IS）：-5500 V（ESI-）；</p><p>　　

30、氣簾氣（CUR）：20 L/min；</p><p>　　霧化器（GS1）：45 L/min； </p><p>　　輔助氣壓力（GS2）：35 L/min； </p><p>　　離子源溫度（TEM）：500 ℃。 </p><p>　　負離子模式下8種植物生長調(diào)節(jié)劑定性、定量離子對和質(zhì)譜分析參數(shù)</p><p>&

31、lt;b>　　*定量離子對。</b></p><p>　　2）正離子模式掃描質(zhì)譜條件</p><p>　　離子源：電噴霧離子源（ESI源）；</p><p>　　檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；</p><p>　　電噴霧電壓（IS）：5500 V（ESI+）；</p><p>　　氣簾氣（CUR）：

32、20 L/min；</p><p>　　霧化器（GS1）：45 L/min； </p><p>　　輔助氣壓力（GS2）：35 L/min； </p><p>　　離子源溫度（TEM）：500 ℃。 </p><p>　　正離子模式下3種植物生長調(diào)節(jié)劑定性、定量離子對和質(zhì)譜分析參數(shù)</p><p><b>　

33、　*定量離子對。</b></p><p>　　注：附錄B所列參考質(zhì)譜條件僅供參考，當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。</p><p><b>　　附錄C </b></p><p>　　11種植物生長調(diào)節(jié)劑特征離子的提取離子流圖</p><p>　　11種植物生長調(diào)節(jié)劑特

34、征離子的提取離子流圖（濃度：均10 ug/kg）</p><p>　　本方法負責(zé)起草單位：上海市食品藥品檢驗所。</p><p>　　驗證單位：廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心、江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心、河北省食品檢驗研究院。</p><p>　　主要起草人：劉暢、張瀘文、王柯、夏蘇捷、徐