魚類來源的兩種抗菌肽BPI和LEAP2的cDNA克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、抗生素的濫用導(dǎo)致了大量的耐藥菌株的出現(xiàn),尋找結(jié)構(gòu)特異的新型藥物來對(duì)抗這些耐藥菌已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急?？咕氖蔷哂袕?qiáng)抗菌作用小分子多肽,是生物先天免疫的重要組成成分,可保護(hù)機(jī)體免受革蘭氏陽性菌和陰性菌、真菌、病毒等病原微生物的入侵,有望部分替代抗生素。魚類是水生生物群的重要組成部分,水環(huán)境中有上千種魚類,而每種魚類又可以分泌幾種不同結(jié)構(gòu)的抗菌肽。本文主要研究其中兩種,一種是斑點(diǎn)叉尾鮰和鯉魚來源的抗菌肽殺菌/滲透增強(qiáng)蛋白(bactericida

2、l/permeability increasing protein,BPI),另一種是斑點(diǎn)叉尾鮰來源的肝臟表達(dá)的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide2, LEAP2)。國內(nèi)外有關(guān)這兩種魚類來源抗菌肽的基因工程方面的報(bào)道很少。
　　BPI是生物機(jī)體細(xì)胞中表達(dá)的一種能夠特異性殺滅革蘭氏陰性菌的抗菌類蛋白,該蛋白包括氨基端和羧基端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中氨基端結(jié)構(gòu)域主要承擔(dān)殺菌和中和內(nèi)毒素的功能。

3、參考已經(jīng)報(bào)道的對(duì)人類BPI進(jìn)行重組DNA表達(dá)的研究結(jié)果,首先通過RT-PCR和巢式PCR從斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)鰓中克隆了編碼BPI氨基端活性結(jié)構(gòu)域的cDNA片段“BPINtd”以及含有終止密碼子的片段“BPINtdcf”,此兩個(gè)片段均由175個(gè)氨基酸殘基組成,其中63個(gè)氨基酸殘基在空間上形成一個(gè)非極性的脂質(zhì)結(jié)合袋,與革蘭氏陰性菌外膜上脂多糖(LPS)結(jié)合,從而改變細(xì)菌膜的通透性,達(dá)到殺菌的效果。根據(jù)斑點(diǎn)叉

4、尾鮰與其他生物之間BPI氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)氨基端存在40個(gè)保守的氨基酸殘基,其中9個(gè)高度保守的殘基位于脂多糖結(jié)合區(qū)域內(nèi)。為了進(jìn)一步建立原核表達(dá)系統(tǒng),根據(jù)pET-32a(+)和pET-28a(+)兩種質(zhì)粒的不同特點(diǎn),選擇其作為原核表達(dá)質(zhì)粒,將“BPINtd”片段分別插入兩種質(zhì)粒,通過菌落PCR、EcoR I和Hind III雙酶切反應(yīng)以及DNA測(cè)序等方法,證明了重組表達(dá)質(zhì)粒“pET-32a-BPINtd”和“pET-28a-BPI

5、Ntd”已被成功構(gòu)建。同時(shí)將“BPINtdcf”將該片段插入到pET-28a(+)中,通過菌落PCR、Nde I和Bam HI雙酶切以及DNA測(cè)序等,證明重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET-28a-BPINtdcf”被成功構(gòu)建。
　　本文通過RT-PCR和巢式PCR從鯉魚(Cyprinus carpio)鰓中克隆了編碼BPI氨基端的活性結(jié)構(gòu)域“BPINtdcp”,該片段由211個(gè)氨基酸殘基組成,也包含由63個(gè)氨基酸殘基組成的脂多糖結(jié)合位點(diǎn)。將該

6、片段插入到pET-28a(+)中,通過菌落PCR、Nde I和Hind III雙酶切以及DNA測(cè)序,證明了重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET-28a-BPINtdcp”被成功構(gòu)建。
　　肝臟表達(dá)的抗菌肽2(LEAP2)最先是從人血液超過濾產(chǎn)物中得到了含有2對(duì)二硫鍵的肝臟表達(dá)的抗菌肽。本文以斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟為基因克隆的材料,通過RT-PCR對(duì)編碼LEAP2成熟肽區(qū)域41個(gè)氨基酸的cDNA進(jìn)行克隆。根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰與其他魚類及哺乳動(dòng)物L(fēng)EAP2成熟肽區(qū)

7、域氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)存在14個(gè)保守的氨基酸殘基,其中4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽的羧基端區(qū)域,在空間上可形成2對(duì)二硫鍵,被推測(cè)與LEAP2的抗菌活性有關(guān)。進(jìn)一步構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)?！皃ET-32a-mLEAP2”,使mLEAP2基因與攜帶有6 x His-tag標(biāo)簽和腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的硫氧還蛋白trxA基因融合,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后,在25℃下,經(jīng)0.7 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)16h后,成功表達(dá)了“trx

8、A-mLEAP2”融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE顯示,細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金屬離子親和層析(IMAC)對(duì)其進(jìn)行純化,得到了純化的融合蛋白。
　　本文進(jìn)一步以“mLEAP2”為模板重新克隆,克隆后得到的新的片段“mLEAP2kex2”含有Xho I和Xba I的酶切位點(diǎn)以及Kex2酶識(shí)別位點(diǎn)“AAAAGA”,這個(gè)酶切位點(diǎn)的加入可以使α因子信號(hào)肽與外源片段的融合蛋白分泌到胞外后,α因子信號(hào)肽