1、附睪作為羊膜動物雄性生殖系統(tǒng)中重要的器官，為精子的成熟、保護(hù)、運輸和儲存提供了特殊的微環(huán)境，在生殖過程中起著關(guān)鍵作用。隨著生殖生物學(xué)的不斷發(fā)展，近些年對于附睪的研究逐漸成為熱點，然而，目前的研究主要集中在哺乳動物，有關(guān)其他脊椎動物附睪的研究鮮有報道。
爬行動物是第一批真正擺脫對水依賴而登陸的脊椎動物，也是最早的羊膜動物，在動物進(jìn)化史上占據(jù)十分重要的地位。爬行動物由于其變溫和冬眠的特殊生理適應(yīng)性，在進(jìn)化過程中形成了許多不同于其它
2、脊椎動物的生命現(xiàn)象，生殖道內(nèi)長期的精子儲存就是其中之一。與輸卵管不同，爬行動物的附睪不僅可以長期儲存精子，還是精子成熟的主要場所。然而，至今關(guān)于爬行動物附睪的研究大多見于有鱗目，且主要集中形態(tài)學(xué)方面，較深入的研究極少。中華鱉是爬行綱龜鱉目的代表物種之一，具有典型的冬眠特性和精子儲存現(xiàn)象，在我國分布極廣，是研究爬行動物附睪生物學(xué)特性的理想模式動物。本文首先對中華鱉附睪的組織結(jié)構(gòu)和附睪內(nèi)精子的形態(tài)特征進(jìn)行了觀察，進(jìn)而對附睪內(nèi)離子、雌激素受體
3、α（ERα）和超氧化物歧化酶在生殖周期內(nèi)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。研究結(jié)果將從細(xì)胞和分子水平闡明中華鱉附睪微環(huán)境與精子生物學(xué)特性的關(guān)系，以期為中華鱉的人工繁殖，種群保護(hù)和精子液態(tài)儲存提供可行性依據(jù)。
試驗一中華鱉附睪的微細(xì)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞組成
應(yīng)用光鏡和透射電鏡技術(shù)觀察中華鱉附睪的組織結(jié)構(gòu)特征及其季節(jié)性變化規(guī)律。中華鱉附睪按其解剖學(xué)特征，大致可分為頭部、體部和尾部三部分。體視顯微鏡下可見22-28條輸出小管出睪丸網(wǎng)后與附睪管相
4、連。輸出小管上皮主要由無纖毛細(xì)胞組成，其間夾雜著少量的纖毛細(xì)胞。生殖期與冬眠期相比，附睪上皮的高度存在顯著性變化。附睪上皮由主細(xì)胞、亮細(xì)胞、頂細(xì)胞、狹窄細(xì)胞和基細(xì)胞五種類型組成。主細(xì)胞數(shù)目最多，與基細(xì)胞一起廣泛存在于附睪各段。透射電鏡下可見主細(xì)胞兼有分泌和吸收兩種功能。狹窄細(xì)胞和頂細(xì)胞的數(shù)目極少，且僅見于附睪頭部。亮細(xì)胞胞質(zhì)較淡，電子密度低，位于附睪體部和尾部，與上述細(xì)胞不同，該細(xì)胞PAS反應(yīng)呈強陽性，也具備分泌功能，分泌方式為全漿分泌
5、。附睪腔內(nèi)精子儲存現(xiàn)象全年可見。電鏡下，除大多數(shù)成熟的精子外，一部分?jǐn)y帶胞質(zhì)小葉的未成熟精子也被發(fā)現(xiàn)。此外，精子還與附睪上皮相互作用，一方面附睪腔內(nèi)精子插入上皮分泌物內(nèi)，另一方面，精子還插入到上皮細(xì)胞間隙內(nèi)。附睪小體樣膜泡首次被發(fā)現(xiàn)，其可結(jié)合到成熟精子和未成熟精子的膜表面，很可能參與精子的成熟。中華鱉附睪的結(jié)構(gòu)與其它爬行動物差異明顯;精子與附睪上皮相互作用以及附睪小體樣膜泡的發(fā)現(xiàn)，表明中華鱉附睪不是單純的精子儲存器官，也可為精子的成熟提
6、供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
試驗二中華鱉附睪內(nèi)精子形成
應(yīng)用光鏡和電鏡技術(shù)觀察了冬眠期中華鱉附睪內(nèi)精子顯微和超微結(jié)構(gòu)變化。光鏡下可見，精子排放（12月份初）時，少量的精細(xì)胞和正在變態(tài)過程中的精子被一起從睪丸排出，進(jìn)入睪丸網(wǎng)和輸出小管內(nèi)。在附睪各段管腔內(nèi)均可觀察到變態(tài)發(fā)育的精子細(xì)胞，電鏡結(jié)果表明其變態(tài)過程具有連續(xù)性。12月掃描電鏡可見，附睪頭部管腔內(nèi)包含一定數(shù)量的圓球形或橢圓形的精子細(xì)胞。有些細(xì)胞表面開始出現(xiàn)凹窩或隆起。運輸?shù)?/p>
7、附睪體部的精子細(xì)胞已獲得一定的發(fā)育，其鞭毛突出并纏繞在精子細(xì)胞表面，同時，精子細(xì)胞內(nèi)多余的細(xì)胞質(zhì)逐漸被消除，精子細(xì)胞體積顯著變小;隨著多余胞質(zhì)小葉的排除，精子形態(tài)趨于成熟。在精細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞核的變化主要表現(xiàn)在胞核的拉長變形和染色質(zhì)的濃縮兩個方面，且兩者同步進(jìn)行。透射電鏡下可見，染色質(zhì)由早期松散淡染的細(xì)小顆粒逐漸融合成粗大致密的顆粒，顆粒之間有細(xì)絲相連;隨著染色質(zhì)顆粒不斷地相互融合，顆粒間隙逐漸消失，最終細(xì)胞核濃縮成致密均質(zhì)狀。精子涂片顯
8、示，變態(tài)精子細(xì)胞的比例隨儲存時間的延長而降低。冬眠初期（12月份）附睪頭部、體部和尾部處于變態(tài)過程中的精子分別為11.4％，7.8％和3.7％，而到了冬眠末期（3月份）其比例下降到2.6％，3.2％和1.6％。流式細(xì)胞結(jié)果顯示95％以上的精子具有活性，且在儲存期各月間各段內(nèi)活精子數(shù)目差異不顯著(P＞0.05)?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們推測精子形成（至少從細(xì)胞核濃縮開始）可在附睪內(nèi)完成。與傳統(tǒng)的、必須在支持細(xì)胞協(xié)助下完成的精子形成相比，游離精子
9、細(xì)胞在附睪內(nèi)的變態(tài)發(fā)育過程，其表面和空間結(jié)構(gòu)變化易于觀察和研究，因此，中華鱉附睪或許可以成為研究精子形成的獨特的模型。
試驗三生殖期中華鱉附睪尾部精子超微結(jié)構(gòu)
應(yīng)用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)研究了生殖期（5-8月）中華鱉附睪尾部精子的超微結(jié)構(gòu)特征。成熟精子體態(tài)細(xì)長，呈蚯蚓狀，總體上可分為頭部和尾部兩部分，尾部又可分為中段、主段和末段。與許多鳥類、兩棲類以及其他爬行動物精子的形態(tài)類似。但也存在一些獨特性：
(1)
10、2-3條核內(nèi)小管穿過頂體下錐，進(jìn)入核前突，止于核體部;
(2)中段由中央的中心粒和周圍的線粒體鞘組成。線粒體鞘由8圈線粒體環(huán)形排列而成，每圈5個線粒體，相鄰層的線粒體錯位1/2排列;
(3)線粒體呈球狀，中央為一致密的核心，外周由8-10層同心圓狀排列的雙層膜構(gòu)成。
除成熟精子外，還觀察到21.4±3.6％形態(tài)尚未成熟的精子。與成熟精子不同，掃描電鏡顯示未成熟精子仍被一定量的細(xì)胞質(zhì)滴附著，少量的未成熟精子的
11、尾部纏繞在較大的細(xì)胞質(zhì)滴周圍而未伸展開。透射電鏡下可見大量的細(xì)胞質(zhì)附著于精子表面，被外面的細(xì)胞膜包裹，甚至在細(xì)胞質(zhì)中仍然存在游離的線粒體和高電子密度物質(zhì)。大多數(shù)未成熟精子已展開，僅存在少量的細(xì)胞質(zhì)滴附著于精子頭部后端和中段的連接處，細(xì)胞質(zhì)滴主要由小膜泡和脂滴組成。脂滴常位于線粒體周圍，可能與線粒體的形態(tài)發(fā)生或退化有關(guān)。附睪尾部的未成熟精子活力正常，但能否正常受精尚不可知。生殖期附睪尾部未成熟精子的存在，表明尾部或也參與精子成熟作用。 12、r> 試驗四中華鱉附睪液中5種金屬離子含量與精子活力相關(guān)性分析
為了研究中華鱉附睪內(nèi)微量元素含量與其精子活力之間的關(guān)系，本試驗采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)測定了中華鱉冬眠期和生殖期內(nèi)各段附睪液中Ca2+、Mg2+，Zn2+、Cu2+、Fe2+等5種金屬離子的含量，利用計算機輔助精子分析儀(CASA)測定了生殖周期內(nèi)附睪各段精子的活力，并對二者進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明:精子活力與附睪液中Zn+、Ca2+極
13、顯著相關(guān)，與Mg2+顯著相關(guān)，而與Fe2+和Cu2+相關(guān)性不大，表明中華鱉附睪內(nèi)Zn2+、Ca2+和Mg2+在調(diào)節(jié)其精子活力方面發(fā)揮了重要的作用，可能是精子在附睪環(huán)境內(nèi)能夠長期儲存的重要因素。
試驗五中華鱉附睪內(nèi)ERα的季節(jié)性表達(dá)與分布
生殖周期內(nèi)，從中華鱉附睪各段組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出ERα基因的cDNA，目的條帶測序驗證后，采用半定量RT-PCR方法研究ERα基因在附睪各段組織內(nèi)的表達(dá)。并采用
14、免疫組織化學(xué)方法研究了雌激素受體α在中華鱉附睪各段組織中的分布定位，以探討ERα在附睪內(nèi)的變化規(guī)律和作用。結(jié)果顯示，生殖期（6、8月份），附睪各段組織中ERαmRNA表達(dá)水平依次為，附睪頭部＞體部＞尾部;而冬眠期（12、2月份）ERmRNA表達(dá)水平與生殖期相反，即:附睪尾部＞體部＞頭部。免疫組織化學(xué)結(jié)果與基因表達(dá)水平基本一致;陽性反應(yīng)主要見于輸出小管和附睪管上皮細(xì)胞的胞核，輸出小管中纖毛細(xì)胞較非纖毛細(xì)胞陽性反應(yīng)強烈;附睪上皮ERα陽性反
15、應(yīng)主要見于主細(xì)胞和基細(xì)胞;胞質(zhì)及附睪管腔內(nèi)也可見一定程度的陽性反應(yīng)。ERα在附睪各段內(nèi)表達(dá)呈季節(jié)性變化，表明它可能與精子在附睪內(nèi)成熟和儲存有密切的關(guān)系。
試驗六中華鱉附睪內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活力的季節(jié)性變化
為研究生殖周期內(nèi)中華鱉附睪超氧化物歧化酶(SOD)的變化，利用SOD活力測定試劑盒，分別測定了生殖期（6月和8月）和冬眠期（12月和2月）附睪各段組織及管腔液內(nèi)SOD的活力。結(jié)果顯示，在整個生殖周期內(nèi)，各段
16、附睪液中SOD活力差異較大，且同一部位附睪液內(nèi)SOD的活力生殖期高于冬眠期。生殖期內(nèi)，尾部的附睪液SOD活力最高，為1518.53±124.88U/mL,與頭部和體部差異顯著（P＜0.05）。冬眠期內(nèi)，頭部附睪液SOD活力最高，為508.45±45.40U/mL，與體部與尾部差異顯著（P＜0.05）。生殖期附睪尾部組織中SOD的活力最高，為137.58±14.81U/mgprot，與附睪體部差異顯著(P＜0.05)，與附睪頭部差異未達(dá)到
17、顯著水平(P＞0.05)。冬眠期附睪組織中SOD的活力低于生殖期，且各段之間SOD的活力差異不顯著（P＞0.05）。附睪中SOD活力呈季節(jié)性變化，表明它可能與精子在附睪內(nèi)運動和儲存具有一定的相關(guān)性。
試驗七中華鱉SOD家族的基因克隆、原核表達(dá)、多抗制備及其在附睪內(nèi)的表達(dá)
(Ⅰ)中華鱉附睪SOD家族的基因克隆與分析根據(jù)物種間序列的保守性，設(shè)計簡并引物，采用RT-PCR方法于中華鱉附睪組織中克隆SOD家族中的Cu/Zn-
18、SOD和Mn-SOD基因片段。PCR產(chǎn)物回收純化后連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，對陽性克隆測序。測得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因片段分別長279bp和486bp，提交GeneBank后獲得兩個登錄號，分別為JN084035和JN159970。將推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行比對，結(jié)果顯示中華鱉的Cu/Zn-SOD基因和氨基酸序列均與烏龜和人的同源性較高;而Mn-SOD基因與氨基酸序列與蜥蜴和雞的同源性高。二者與金屬離
19、子結(jié)合的位點高度保守，未發(fā)生變異。
(Ⅱ)Cu/Zn-SOD的原棱表達(dá)、多抗制備及在附睪液內(nèi)的表達(dá)Cu/Zn-SOD是超氧化物歧化酶(SOD)家族中的重要成員之一，在機體抗氧化過程中發(fā)揮著重要的作用。為獲得中華鱉Cu/Zn-SOD的多克隆抗體，用以研究其在中華鱉附睪各段管腔液中的表達(dá)情況;上一節(jié)中已獲得的中華鱉Cu/Zn-SOD基因片段為模板，設(shè)計引物加入酶切位點，進(jìn)行PCR擴增。PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pColdI經(jīng)限制性內(nèi)
20、切酶NdeI、XhoI消化后，連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pColdI-Cu/Zn-SOD。在異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，實現(xiàn)了Cu/Zn-SOD的有效表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在破碎菌液上清中獲得大小13kd左右的的重組蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+親和層析柱和分子篩純化后免疫兔子制備多抗，三免后采血并分離出血清即為抗血清。間接Elisa測得多抗效價在1∶64000以上，Wester
評論
0/150
提交評論