豬鏈球菌流行病學(xué)及其生物被膜形成機(jī)理研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種重要的人畜共患致病性病原菌,可以導(dǎo)致宿主出現(xiàn)化膿性腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎和關(guān)節(jié)炎等,到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了33個(gè)血清型(1-31,33,和1/2)。2005年夏天,以四川資陽為中心,爆發(fā)了大規(guī)模的豬鏈球菌疫情,死亡豬只647頭,共有215人遭受感染,其中38人死亡。這些人豬鏈球菌疫情將豬鏈球菌的公共衛(wèi)生意義提升到一個(gè)新高度。本研究系統(tǒng)分析了豬鏈球菌在我國(guó)豬鏈球菌病中的重要性、相關(guān)毒力因子及基因型與致病力的關(guān)系。豬血

2、漿中的主要成分血纖維蛋白原能夠誘導(dǎo)豬鏈球菌形成生物被膜,病原菌形成生物被膜是病原菌致病的一種機(jī)制,通過形成生物被膜,細(xì)菌變成持續(xù)性感染,抵抗宿主先天性和特異性免疫系統(tǒng)的清除,幫助細(xì)菌抵抗抗生素的殺害。本研究發(fā)現(xiàn)生物被膜形成能力的菌株對(duì)比相同基因型的菌株的毒力減弱。通過生物芯片對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成后的轉(zhuǎn)錄組與未形成生物被膜的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了兩個(gè)與生物被膜和致病力相關(guān)的基因。現(xiàn)將主要研究結(jié)果報(bào)告如下:
　　 1.

3、我國(guó)豬鏈球菌分子流行病學(xué)相關(guān)研究
　　 通過系統(tǒng)的流行病學(xué)分析調(diào)查,2003-2007年間,在全國(guó)共分離到407株豬鏈球菌,占分離的豬源鏈球菌總數(shù)的56.6％,已經(jīng)取代馬鏈球菌獸疫亞種成為我國(guó)豬鏈球菌病的主要病原。在這些豬鏈球菌中,血清2型占43.2％,3型占14.7％,其次為4,8,5,7,1/2型(3.2％-6.4％)。2型和系統(tǒng)感染顯著相關(guān),3型和肺炎型病例顯著相關(guān)。54％的2型菌株屬于基因型sly+mrp+epf+,這種

4、基因型通過小鼠感染試驗(yàn)證實(shí)與高毒力顯著相關(guān)。繼續(xù)對(duì)2008-2009年間的流行病學(xué)調(diào)查表明,2型豬鏈球菌無論是在肺炎型病例還是在系統(tǒng)感染病例中的比例始終最高。3型豬鏈球菌的在肺炎型病例中的重要性已經(jīng)下降,21型有上升趨勢(shì),2型豬鏈球菌已經(jīng)成為我國(guó)豬鏈球菌病的主要血清型。通過四環(huán)素抗性基因種類分析和MLST分型,我國(guó)爆發(fā)的人豬鏈球菌菌株在這些2型鏈球菌中僅少量存在。我國(guó)分離菌株大部分處于毒力強(qiáng)的ST1和ST27complex中,且存在一部

5、分超強(qiáng)毒力ST1和ST7型的菌株,且這些菌株在不斷發(fā)生演化。外周血吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示豬鏈球菌的抗吞噬能力與ST型密切相關(guān)。ST1相關(guān)菌株最強(qiáng),ST7,ST27 complex的菌株其次,其他ST型菌株最弱。最后,為了快速對(duì)這些豬鏈球菌進(jìn)行MLST鑒定進(jìn)行流行病學(xué)分析,建立了核酸質(zhì)譜分型方法,該方法完成分析僅需要6.5小時(shí),為快速對(duì)豬鏈球菌進(jìn)行分型奠定基礎(chǔ)。
　　 2.豬鏈球菌生物被膜形成菌株的初步應(yīng)用
　　 從大量的臨床分

6、離株中發(fā)現(xiàn)了一株具有生物被膜形成能力,基因型sly+mrp+epf+的低毒力2型豬鏈球菌菌株。實(shí)驗(yàn)證明該株菌對(duì)豬具有很強(qiáng)的免疫原性,用該菌免疫豬后能夠抵抗2型強(qiáng)毒的攻擊,但是對(duì)仔豬的安全劑量為5000萬。因此,為了保留其免疫原性,進(jìn)一步提高此菌株的安全性,繼續(xù)對(duì)該菌的芳香族氨基酸合成相關(guān)基因aroC基因進(jìn)行缺失。結(jié)果表明:突變株在未補(bǔ)加芳香簇氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度顯著下降,但是當(dāng)培養(yǎng)基中添加三種芳香簇氨基酸后,其生長(zhǎng)速度回復(fù)。為檢測(cè)其

7、安全性和免疫效力,用1億和10億兩個(gè)劑量組分別免疫仔豬,二免后第二周檢測(cè)抗體同時(shí)攻毒。兩個(gè)劑量組免疫后安全性良好。第二次免疫后第二周,用2型豬鏈球菌莢膜多糖包被ELISA板測(cè)定抗體水平顯著上升。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組在第3天全部死亡,1億免疫劑量組2/4保護(hù),保護(hù)率50％。10億免疫劑量組3/4保護(hù),保護(hù)率75％。取免疫保護(hù)組和對(duì)照組攻毒后的組織(腦,肺,心肌,脾臟)進(jìn)行病理切片分析其病理變化,結(jié)果表明:對(duì)照組對(duì)比免疫保護(hù)組,存在明

8、顯的腦神經(jīng)元壞死,心肌出血,脾壞死。對(duì)照組比免疫保護(hù)組的肺組織存在更嚴(yán)重的肺不張。
　　 3.豬鏈球菌生物被膜形成機(jī)制初步探討及新的毒力相關(guān)基因發(fā)掘
　　 通過比較普通培養(yǎng)基和添加纖維蛋白原的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的豬鏈球菌轉(zhuǎn)錄組的差異來探討豬鏈球菌形成生物被膜的機(jī)制。
　　 (1)結(jié)果顯示,共有648個(gè)基因的表達(dá)差異在兩倍以上。其中330個(gè)基因表達(dá)下調(diào),318個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。生物被膜形成的過程中由于周圍營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度降低

9、,細(xì)菌的生長(zhǎng)開始延緩,相應(yīng)的細(xì)菌的代謝速度降低,大量蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因,核糖體結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)基因,氨基酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因,糖類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因,DNA復(fù)制相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)。另一方面,細(xì)菌通過生物被膜形成,下調(diào)表達(dá)細(xì)胞壁和莢膜多糖合成相關(guān)基因,上調(diào)表達(dá)菌毛輸出相關(guān)基因和Sortase基因,溶血素相關(guān)基因等,這些基因的上調(diào)表達(dá)為豬鏈球菌在宿主黏附定植從而建立感染。
　　 (2)對(duì)上調(diào)表達(dá)幅度較大的兩個(gè)基因leuD和autolysi

10、n基因繼續(xù)深入研究。通過定量PCR發(fā)現(xiàn),leuD基因在生物被膜形成過程中轉(zhuǎn)錄上調(diào)200倍,與芯片結(jié)果趨勢(shì)一致。Autolysin也存在一定程度的上調(diào)表達(dá),暗示這兩個(gè)基因與生物被膜形成密切相關(guān)。繼續(xù)構(gòu)建突變體和回復(fù)突變體驗(yàn)證其功能,結(jié)果表明兩個(gè)基因?qū)ι锉荒ば纬赡芰?對(duì)Hep-2細(xì)胞的黏附和毒力,對(duì)豬肺上皮細(xì)胞SJPLC細(xì)胞系的毒力都顯著下降。最后,豬外周血細(xì)胞吞噬試驗(yàn)證明:autolysin突變株的存活能力相對(duì)于野生株的存活能力平均下降