溶菌酶-綠色熒光蛋白(Lyz-GFP)雙元基因?qū)俎＾D(zhuǎn)化的研究.pdf

1、苜蓿（Medicago sativa L.）屬豆科多年生草本，是世界上最重要的飼料作物，在苜蓿的生產(chǎn)實(shí)踐中往往會(huì)遇到一些病原微生物的侵染而導(dǎo)致苜蓿病害，病害嚴(yán)重時(shí)造成苜蓿減產(chǎn)和毀滅性損傷，帶來(lái)極大的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失。將抗病基因?qū)胲俎Ｔ耘嗥贩N中，可以在短期內(nèi)直接地改良苜蓿的抗病性能。本論文以甘農(nóng)1號(hào)雜花苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿為供試材料，研究了其再生過(guò)程中的若干影響因素，探討并掌握了再生條件，確定了適合2種苜蓿植株再生的最佳培養(yǎng)基；同時(shí)利用

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將綠色熒光蛋白（GFP）基因標(biāo)記的抗病基因-溶菌酶（Lyz）基因?qū)氲?個(gè)品種的苜蓿中，系統(tǒng)地研究了基因轉(zhuǎn)化條件，建立了適宜的轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)一步通過(guò)熒光顯微鏡和PCR檢測(cè)，證實(shí)Lyz-GFP雙元基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入2種苜蓿中。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 ⑴再生體系的建立。以甘農(nóng)1號(hào)和甘農(nóng)3號(hào)苜蓿為供試材料，進(jìn)行了其愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根的研究。結(jié)果表明：下胚軸為甘農(nóng)1號(hào)雜花苜蓿和甘農(nóng)3號(hào)紫花苜蓿再生的最佳外植體；最適

3、誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+0.7％瓊脂+2.5％蔗糖，誘導(dǎo)時(shí)間為30 d；最佳的芽分化培養(yǎng)基為MS+0.3mg/L NAA+0.7％瓊脂+2.0％蔗糖；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/LNAA+0.7％瓊脂+2.0％蔗糖。甘農(nóng)1號(hào)最佳愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率分別為100％和28％，而甘農(nóng)3號(hào)的最佳愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率分別為100％和25％。
　　 ⑵農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化體系的建立。

4、以培養(yǎng)7～10d的2個(gè)苜蓿品種的無(wú)菌苗下胚軸為外植體，以農(nóng)桿菌菌株為介體，進(jìn)行了Lyz～GFP雙元基因的轉(zhuǎn)化，獲得了優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化體系：Kan的篩選濃度為75mg/L，篩選方法為延遲選擇；抑菌素選擇Cef較好，濃度為300mg/L；外植體預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間同為3d；用于轉(zhuǎn)化的侵染方式和時(shí)間為搖床上搖動(dòng)10min，適宜的菌液濃度為OD600=0.4～0.5。本研究最終得到4株甘農(nóng)1號(hào)抗性苗和6株甘農(nóng)3號(hào)抗性苗，其中2株甘農(nóng)1號(hào)和4株甘農(nóng)3