引入甘氨酸甲基化合成甜菜堿途徑提高黑麥草抗旱性研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩133頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、黑麥草是世界范圍內(nèi)廣泛種植的冷季型牧草和草坪草。一年生黑麥草(Lolium multiflorum Lam.)和多年生黑麥草(Lolium perenne L.)是兩個重要的黑麥草栽培種。由于黑麥草高度自交不親和,通過傳統(tǒng)育種方法進行遺傳改良復(fù)雜而困難?;蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,打破了物種間基因流動的限制,能將外源基因?qū)敫牧贾参锾囟ǖ男誀?。目前,全球水資源短缺問題日益嚴(yán)峻,干旱嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量,而黑麥草耐旱能力弱。因此提高抗旱性是黑麥

2、草育種的主要目標(biāo)之一,利用生物技術(shù)培育黑麥草抗旱新品種具有重要的經(jīng)濟意義和科學(xué)意義。
   甘氨酸甜菜堿(簡稱甜菜堿)在增強植物抗旱性中有重要作用,通過基因工程途徑提高細(xì)胞甜菜堿含量改善植物抗逆性的研究已有較多工作。甜菜堿可通過膽堿氧化途徑和甘氨酸連續(xù)甲基化途徑合成,其中前一途徑研究較早,一些參與該途徑的酶基因已被克隆并應(yīng)用于植物抗逆基因工程研究。后一途徑近年才發(fā)現(xiàn),目前有關(guān)參與該途徑的酶基因克隆及利用的工作報道很少。以甘氨酸為

3、底物合成甜菜堿,由于甘氨酸在細(xì)胞內(nèi)濃度較高,甜菜堿的大量積累受限較少,因此克隆相關(guān)基因的工作受到關(guān)注。本論文首先從藍細(xì)菌嗜鹽隱桿藻GR02中克隆得到兩個甲基化酶基因ApGSMT2和ApDMT2,它們在轉(zhuǎn)基因大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草中能夠有效催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。然后將它們插入單子葉植物表達載體中,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥草從生芽塊遺傳轉(zhuǎn)化方法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉(zhuǎn)入一年生黑麥草和多年生黑麥草中,獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系,進而開

4、展轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱特性的研究,較深入揭示了轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱性提高的機理。ApGSMT2和ApDMT2基因的克隆和功能確定根據(jù)已報道的嗜鹽隱桿藻來源的甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ApGSMT)和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ApDMT)序列設(shè)計PCR引物,我們從南京大學(xué)分離的嗜鹽隱桿藻GR02中克隆出兩個DNA片段,分別長798 bp和834 bp,各自包含一個開放閱讀框(ORF)。利用生物信息學(xué)方法對這兩條DNA片段進行序列分析和編碼產(chǎn)物

5、的結(jié)構(gòu)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)它們與各種來源的轉(zhuǎn)甲基酶序列相似性較高,它們可能分別編碼甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。將這兩條DNA片段分別命名為ApGSMT2和ApDMT2。與已報道的ApGSMT和ApDMT基因相比,ApGSMT2和ApDMT2基因與它們在核苷酸水平上序列相似性分別為83%和84%,氨基酸序列相似性分別達93%和91%。與其它物種的轉(zhuǎn)甲基酶相比,在氨基酸水平上,ApGSMT2與EcGSMT(來源于Ectothior

6、hodospirahalochloris,一種厭氧光合硫細(xì)菌)為64%,與AcGSDMT(來源于Actinopolysporahalophila,一種需氧異養(yǎng)真細(xì)菌)為64%;ApDMT2與EcSDMT為50%,與AcGSDMT為48%。在ApGSMT2和ApDMT2基因編碼的氨基酸序列中,存在保守的AdoMet(腺苷甲硫氨酸)結(jié)合基序:MotifⅠ,PostⅠ,MotifⅡ和MotifⅢ。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測得出ApGSMT2和ApDMT2各

7、具有一個由7個β-折疊片構(gòu)成的“AdoMet-dependent MTase fold(AdoMet依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶折疊)”結(jié)構(gòu),且這7個β-折疊片是按照(6↓7↑5↓4↓1↓2↓3↓)順序排列。這個結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是甲基轉(zhuǎn)移酶(Mtases)的特征結(jié)構(gòu)。
   為了確定ApGSMT2和ApDMT2基因的功能,將它們共轉(zhuǎn)入E.coli和模式植物煙草中,檢測轉(zhuǎn)基因大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因煙草中甜菜堿含量。在E.coli中共表達ApGSMT2和A

8、pDMT2基因?qū)е绿鸩藟A的合成量增加,與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ占?xì)胞相比,在正常培養(yǎng)條件下甜菜堿含量增加1倍左右。煙草自身不合成甜菜堿。表達ApGSMT2和ApDMT2基因的轉(zhuǎn)基因煙草(GSD株系)中能夠積累甜菜堿(可達0.4436μmol g-1FW)。與轉(zhuǎn)betA基因煙草(betA株系)相比,GSD株系的甜菜堿積累量是betA株系的4.3倍。betA基因編碼催化膽堿合成甜菜堿的酶。不同的甜菜堿積累量可能是兩種轉(zhuǎn)基因煙草合成甜菜堿的底物不同的緣故

9、,GSD株系以甘氨酸為底物,betA株系以膽堿為底物。游離甘氨酸在煙草細(xì)胞中含量豐富,而膽堿的含量比較低。在20%的PEG水溶液中,GSD株系種子萌發(fā)率高達65.2%,顯著高于betA株系(50.9%)。小苗干旱試驗也表明,GSD植株在干旱脅迫下的生長狀況遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于轉(zhuǎn)betA株系的。生理指標(biāo)檢測得出,與轉(zhuǎn)betA株系和野生型相比,干旱脅迫下GSD植株的相對含水量(RWC)較高,膜受損程度較輕,還能保持相對較高的凈光合速率和PSⅡ最大光化學(xué)

10、效率(Fv/Fm)。因而在GSD株系中,甜菜堿可能主要通過在干旱脅迫下維持細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定PSⅡ中心復(fù)合體提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性,抗旱能力與甜菜堿的積累量正相關(guān)。
   在此部分工作中,我們克隆出ApGSMT2和ApDMT2基因,它們編碼的蛋白催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿。對轉(zhuǎn)基因煙草進行抗旱性分析,得出GSD株系的甜菜堿積累量高于轉(zhuǎn)betA株系的,抗旱性也優(yōu)于轉(zhuǎn)betA株系的。這些結(jié)果表明ApGSMT2和ApDMT2基因在植

11、物抗逆基因工程研究中有很好的應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的產(chǎn)生為了轉(zhuǎn)化單子葉植物黑麥草,將ApGSMT2和ApDMT2基因重組到一個單子葉植物表達載體質(zhì)粒上。在這個質(zhì)粒中,ApGSMT2和ApDMT2基因分別被玉米ubiquitin啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。以抗除草劑草甘膦的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(Epsps)基因為植物轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的從生芽塊轉(zhuǎn)化法將ApGSMT2和ApDMT2基因轉(zhuǎn)入一年生黑麥

12、草和多年生黑麥草。通過除草劑篩選和PCR檢測選擇轉(zhuǎn)基因黑麥草植株,采用Southern雜交技術(shù)進‘步確定外源基因是否整合入黑麥草基因組中,利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)確定外源基因在轉(zhuǎn)基因黑麥草中的表達。從黑麥草轉(zhuǎn)化植株中選出了一批穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因材料。轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的抗旱性分析分別以3個轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草T0代無性系和3個來自不同轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草T2代株系為材料進行抗旱性分析。把轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草和野生型(WT)

13、的大小基本一致分蘗移栽到土質(zhì)均一的花盆中,地上部分修剪成5 cm高,恢復(fù)生長4周后,停止供水進行干旱脅迫處理。對于轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草T2代和WT的種子播種到花盆中,經(jīng)除草劑篩選和PCR檢測后,恢復(fù)生長一個月后進行干旱脅迫處理。
   在干旱處理過程中,WT比轉(zhuǎn)基因黑麥草植株萎蔫早,生長受抑制嚴(yán)重,而轉(zhuǎn)基因黑麥草植株根系更發(fā)達,萎蔫較晚,能夠積累更多的生物量。經(jīng)過長時間的干旱脅迫處理,所有的黑麥草株系葉片卷曲,嚴(yán)重失水;但復(fù)水后轉(zhuǎn)

14、基因黑麥草植株可以較快恢復(fù)生長,表現(xiàn)出較高的存活率。這些表型觀察的結(jié)果表明轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因提高了黑麥草的抗旱能力。
   干旱處理前,轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草和轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草的甜菜堿含量分別為3.60~3.83μmol-1FW和2.19~2.31μmol g-1FW,與WT相比沒有明顯差異。干旱處理7天后,轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的甜菜堿積累量均大幅度升高,前者升高幅度更大。如轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草L3的甜菜堿含量達17.

15、34μmol g-1FW,是WT7.91μmol g-1FW的2.19倍;轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草L3的甜菜堿含量為6.12μmolg-1FW,是WT4.3μmol g-1FW的1.42倍。對轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因黑麥草的轉(zhuǎn)基因表達分析得出,干旱脅迫下甜菜堿的含量同轉(zhuǎn)基因表達量呈正相關(guān),即轉(zhuǎn)基因黑麥草在干旱脅迫處理中的甜菜堿增加與轉(zhuǎn)基因表達強度相對應(yīng)。
   測定轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT在干旱處理過程中的生理指標(biāo),以探討轉(zhuǎn)基因黑

16、麥草抗旱性提高的可能機制。干旱處理過程中所有黑麥草株系的葉片RWC和凈光合速率(Pn)均下降,但轉(zhuǎn)基因黑麥草的葉片RWC和Pn的降低幅度顯著小于WT的,并且轉(zhuǎn)基因黑麥草的離子滲漏率和丙二醛(MDA)積累水平均低于WT,即轉(zhuǎn)基因黑麥草株系的葉片細(xì)胞膜受損程度較輕。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因黑麥草的甜菜堿含量增加有效地穩(wěn)定了細(xì)胞膜的完整性,這可能是葉片保持相塒較高RWC和Pn的原因之一。同WT相比,干旱脅迫過程中轉(zhuǎn)基因黑麥草株系能保持相對較高的Pn

17、,一部分歸因于輕微干旱下較高的氣孔導(dǎo)度(gS)能夠保證CO2供應(yīng),另一方面歸因于PSⅡ中心復(fù)合體在嚴(yán)重脅迫下受損較輕。干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因黑麥草的Fv/Fm值高于WT,表明更多甜菜堿的積累可能也有效地保護PSⅡ中心復(fù)合體結(jié)構(gòu)及功能。由于在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因黑麥草能保持較強的光合能力,因此葉片可積累較多的可溶性糖。
   高等植物中各氨基酸的合成途徑之間存在密切聯(lián)系,一種氨基酸量的變化有可能影響整個游離氨基酸庫??紤]到轉(zhuǎn)基因黑麥草消耗甘

18、氨酸合成甜菜堿,有必要分析轉(zhuǎn)基因黑麥草中各游離氨基酸的水平。干旱處理前轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的各游離氨基酸含量沒有顯著差異。干旱處理7天,轉(zhuǎn)基因一年生黑麥草的Gly、Ser和Thr含量顯著低于WT的,而轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草中僅有Gly顯著低于WT。這可能是因為轉(zhuǎn)基因黑麥草中,Gly被消耗合成甜菜堿,需較多的Ser用于Gly合成的結(jié)果。干旱脅迫下,植物能夠積累游離氨基酸,尤其是Pro作為滲透調(diào)節(jié)保護物質(zhì)。干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因黑麥草和WT的游離氨基酸

19、總量和Pro含量均大幅度增加,但轉(zhuǎn)基因材料和WT之間沒有明顯差異,這表明同WT相比,轉(zhuǎn)基因黑麥草抗旱能力的提高與游離氨基酸總量和Pro含量變化無關(guān)。
   檢測轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草中干旱脅迫相關(guān)基因的表達變化,探討引入新的甜菜堿合成途徑對其他基因表達的影響。選擇的基因有兩個DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的同源基因、D1蛋白編碼基因、催化合成膽堿的磷酸膽堿胞苷酰轉(zhuǎn)移酶基因和AQPs基因等。AQPs是水通道蛋白,植物可以通過控制AQPs

20、活性來抵御干旱脅迫,比較分析4個多年生黑麥草的水通道蛋白基因的表達變化,發(fā)現(xiàn)LpTIR2:1和LpTIR1:2基因的表達在轉(zhuǎn)基因植株和WT間有差異,黑麥草積累更多甜菜堿可能促進了它們的表達。但是多數(shù)基因的表達趨勢在轉(zhuǎn)基因株系和WT之間無明顯差別,即未受到轉(zhuǎn)基因的影響。
   在此部分研究中,通過轉(zhuǎn)ApGSMT2和ApDMT2基因,將甘氨酸甲基化合成甜菜堿途徑首次引入黑麥草中。異源表達ApGSMT2和ApDMT2基因增加了黑麥草中

21、甜菜堿的積累量,抗旱能力得到顯著提高。生理學(xué)和分子生物學(xué)分析表明干旱脅迫下在轉(zhuǎn)基因黑麥草中甜菜堿不僅能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜的完整性和PSⅡ中心復(fù)合體,而且還可能影響一些脅迫相關(guān)基因的表達。
   綜上所述,本工作克降出編碼催化甘氨酸甲基化合成甜菜堿的ApGSMT2和ApDMT2基因,通過轉(zhuǎn)基因植物證實了其應(yīng)用價值,豐富了抗逆植物基因工程研究的基因資源。另外,獲得了抗旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因黑麥草材料,為我國黑麥草育種工作做出力所能及的貢獻;

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論