重組質(zhì)粒pET-OmpU的構(gòu)建、表達(dá)及其對錦鯉的免疫保護(hù)作用.pdf

1、水產(chǎn)動物腹水病是由擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus，Vm)引起的一種重要的細(xì)菌性疾病。現(xiàn)階段尚無有效的疫苗用于該病的免疫預(yù)防。外膜蛋白U(OutermembraneproteinU，OmpU)是存在于多種病原弧菌中比較保守的主要外膜蛋白，且已探明該蛋白是霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的保護(hù)性抗原。但擬態(tài)弧菌OmpU蛋白對水產(chǎn)動物是否具有免疫保護(hù)作用至今尚不明了。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了擬態(tài)弧菌安徽分離株的OmpU蛋白，并檢測分析了可溶性

2、重組OmpU蛋白的免疫原性、免疫反應(yīng)性以及對實(shí)驗魚的免疫保護(hù)作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步研制擬態(tài)弧菌OmpU蛋白疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了制備抗擬態(tài)弧菌抗體，將04-13安徽分離株的甲醛滅活菌體(200億個/mL)與雙相乳化佐劑充分乳化制成免疫原免疫家兔。經(jīng)三次免疫后，免疫兔血清中抗菌抗體的凝集價高達(dá)l：225，完全可用于后續(xù)的Westernblot檢測分析。
　　 為了獲得高效表達(dá)的可溶性重組OmpU蛋白，首先應(yīng)用Sign

3、alP在線分析軟件對擬態(tài)弧菌04-13菌株OmpU基因全序列(GenBank收錄號：DQ846743)進(jìn)行信號肽分析，發(fā)現(xiàn)其5’端66bp編碼的22個氨基酸組成信號肽。對此，設(shè)計特異性引物，PCR擴(kuò)增切除信號肽的OmpU基因(1004bp)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定向插入pET-32a(+)載體，構(gòu)建出原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-OmpU。然后采用正交試驗設(shè)計L9(34)方案，通過SDS-PAGE分析培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑

4、濃度等因素對蛋白表達(dá)的影響，優(yōu)化出OmpU蛋白最佳表達(dá)條件，即重組菌pET-32a-OmpU/Rosseta接種LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)3h，然后加入0.5mmol/LIPTG繼續(xù)誘導(dǎo)4h，即可獲得較高表達(dá)量(496mg/L)的可溶性重組OmpU蛋白。
　　 為了分析可溶性重組OmpU蛋白的免疫原性、免疫反應(yīng)性以及對實(shí)驗魚的免疫保護(hù)作用，在優(yōu)化條件下誘導(dǎo)重組菌大量表達(dá)，使用鎳離子金屬螯合親和層析柱對可溶性重組OmpU蛋白進(jìn)行純

5、化并做Westernblot分析。結(jié)果顯示純化后蛋白純度達(dá)98％，濃度為3.2mg/mL，能與抗菌抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。以重組OmpU蛋白、標(biāo)簽蛋白His和滅活菌體免疫錦鯉，四免后第7天心臟采血，采用ELISA檢測試劑盒測定血清IgM含量，同時以濃度為3×109cfu/mL的菌液(100LD50)人工感染錦鯉。結(jié)果顯示，四免后實(shí)驗魚血清IgM含量分別為3.32mg/mL、2.95mg/mL和4.51mg/mL，與陰性血清IgM含量相比(2