不同倍性鯽鯉蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室在世界上首次制備了兩性可育的異源四倍體鯽鯉，該四倍體鯽鯉與二倍體紅鯽雜交獲得的三倍體湘云鯽具有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，分析認(rèn)為主要與其不育有關(guān)。眾所周知，魚(yú)類生長(zhǎng)主要通過(guò)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成來(lái)完成，蛋白質(zhì)代謝直接影響魚(yú)類生長(zhǎng)作用，外源蛋白在魚(yú)體內(nèi)首先降解生成肽類物質(zhì)和游離氨基酸，肽類物質(zhì)在肽酶的作用下，進(jìn)一步降解生成小肽和游離氨基酸，腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體負(fù)責(zé)小肽和氨基酸的吸收，氨基酸在腸道或進(jìn)入體內(nèi)在肝臟發(fā)生代謝作用。因此，本研究克隆了影響不同倍性鯽

2、鯉蛋白質(zhì)代謝的3個(gè)關(guān)鍵基因，并探討了其基因的表達(dá)特征，內(nèi)容總結(jié)如下：
　　 1.氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)是一種從N末端酶切肽鏈的蛋白質(zhì)消化酶，在蛋白質(zhì)消化中發(fā)揮十分重要的作用。本研究克隆紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉APN的部分cDNA序列，結(jié)果表明不同倍性鯽鯉APN序列相對(duì)保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)三倍體湘云鯽APN在腸道組織分

3、布最多，不同倍性鯽鯉APN基因具有母性遺傳特性，參與了早期胚胎發(fā)育各時(shí)期卵黃囊蛋白的消化，但三倍體湘云鯽APN在早期胚胎發(fā)育的多個(gè)時(shí)期均有較高的表達(dá)水平，說(shuō)明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對(duì)蛋白質(zhì)的消化效率高于紅鯽，揭示了它對(duì)蛋白質(zhì)代謝具有消化優(yōu)勢(shì)。
　　 2.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(oligopeptide transporter，PepT1)是依賴質(zhì)子的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(oligopeptide transporter，POT)家族成員

4、之一，腸道上皮細(xì)胞PepT1對(duì)蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物中的小肽吸收起關(guān)鍵性作用。本研究利用同源克隆和RACE方法克隆了紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉PepT1全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)果表明三種倍性鯽鯉PepT1序列相對(duì)保守，氨基酸序列相似率在88.8～93.8之間，在第564個(gè)氨基酸位點(diǎn)，三倍體湘云鯽缺失一個(gè)氨基酸。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)湘云鯽組織表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果表明三倍體湘云鯽PepT1主要分布在腸道前段，并沿腸道縱向表達(dá)量逐漸降低，說(shuō)明了三倍

5、體湘云鯽腸道前段是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物中小肽的主要吸收?qǐng)鏊?。同樣，利用?shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)不同倍性鯽鯉早期胚胎發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PepT1在不同倍性鯽鯉具有母性遺傳特性，三倍體湘云鯽PepT1在早期胚胎發(fā)育的多個(gè)時(shí)期有較高水平的表達(dá)，說(shuō)明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對(duì)蛋白質(zhì)的吸收效率高于紅鯽，揭示了它對(duì)蛋白質(zhì)代謝具有吸收優(yōu)勢(shì)。
　　 3.谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase)是氨基酸代謝和糖代

6、謝的重要街接點(diǎn)之一，對(duì)氨基酸代謝有十分重要的作用。本研究克隆紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉GDH全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)果表明三種魚(yú)GDH氨基酸序列高度保守。實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)不同倍性鯽鯉GDH廣泛分布在所有組織，在繁殖和非繁殖季節(jié)，三倍體湘云鯽肝臟組織GDHmRNA表達(dá)量均高于紅鯽。早期胚胎發(fā)育階段，GDHmRNA在三倍體湘云鯽表達(dá)量最高，說(shuō)明在早期胚胎發(fā)育階段，三倍體湘云鯽對(duì)氨基酸的代謝效率高于紅鯽，揭示它具有氨基酸代謝優(yōu)勢(shì)。<

7、br>　　 4.研究了二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化。每種倍性的魚(yú)設(shè)1個(gè)處理，每個(gè)處理三重復(fù)，投喂初始平均體重59.0g左右的同齡魚(yú)30天。結(jié)果表明三倍體湘云鯽增重率是二倍體紅鯽的2.13倍。湘云鯽相對(duì)紅鯽血清尿素氮、甲狀腺激素(T3、T4)濃度降低，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度升高，成體腸道APN、PepT1和肝臟GDH基因的表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明了在成體發(fā)育階段，湘云鯽具有明顯

8、蛋白質(zhì)代謝優(yōu)勢(shì)。
　　 5.研究了蛋白質(zhì)水平和種類對(duì)湘云鯽APN、PepT1、GDH基因表達(dá)的影響。配制了5種蛋白水平和2種蛋白種類的半精制飼料，每種飼料設(shè)1個(gè)處理，每個(gè)處理三重復(fù)，飼喂初始體重50g左右的同一批孵化湘云鯽40天，結(jié)果表明飼料蛋白水平和種類均能顯著影響湘云鯽腸道APN、GDH、PepT1基因的表達(dá)，湘云鯽APN基因的表達(dá)與腸道部位和蛋白濃度有相關(guān)性；蛋白水平主要影響湘云鯽中腸GDH基因的表達(dá)，其表達(dá)量隨蛋白水平增

9、加顯著上調(diào)(P<0.05)；低蛋白和高蛋白均能提高湘云鯽腸道PepT1基因的表達(dá)。魚(yú)粉相對(duì)豆粕而言，它能顯著提高湘云鯽腸道APN、GDH、PepT1基因的表達(dá)。
　　 6.研究了丁酸鈉對(duì)湘云鯽生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及腸道APN、GDH、PepT1基因的表達(dá)的影響。在湘云鯽基礎(chǔ)飼料中添加5種不同劑量丁酸鈉，投喂49天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定其生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和腸道APN、GDH、PepT1基因的表達(dá)豐度，結(jié)果表明隨丁酸鈉添加劑量的

10、增加，不同處理組對(duì)湘云鯽特定生長(zhǎng)率先增大后減少，0.25g/kg丁酸鈉組湘云鯽特定生長(zhǎng)率最高(21.12％)，餌料系數(shù)最低(2.03)，0.50g/kg丁酸鈉處理組湘云鯽的血清總蛋白(TP)最高，是對(duì)照組的2.47倍。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性高于對(duì)照組，尿素氮(UN)濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。添加劑丁酸鈉顯著提高湘云鯽腸道組織PepT1mRNA的表達(dá)，并呈劑量依賴效應(yīng)。丁酸鈉調(diào)節(jié)湘云鯽腸道組織

11、APN表達(dá)特征是先下調(diào)后上調(diào)，調(diào)節(jié)GDH表達(dá)豐度特征是先上調(diào)后下調(diào)。
　　 7.研究了微生態(tài)制劑對(duì)湘云鯽生產(chǎn)性能和腸道GDH、APN和PepT1基因表達(dá)的影響，在湘云鯽基礎(chǔ)飼料中添加0.0g/kg、0.1g/kg、和0.2g/kg，投喂56天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定其生長(zhǎng)性能和腸道APN、GDH、PepT1基因的表達(dá)豐度。結(jié)果表明0.1g/kg組湘云鯽增重率和特定生長(zhǎng)率最高，極顯著高于對(duì)組照(p<0.01)，是對(duì)照組的1.47和1.2