斑點(diǎn)叉尾鮰病毒囊膜蛋白的鑒定及定位研究.pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)是最早被發(fā)現(xiàn)的魚(yú)類皰疹病毒。因?yàn)橥ㄟ^(guò)SignaIP3.0(Bendtsen et al.2004)and SOSUI(Hirokawa et al.1998)計(jì)算程序，orf10被預(yù)測(cè)編碼Ⅰ型囊膜蛋白。該囊膜蛋白具有一個(gè)潛在的裂解信號(hào)序列(amino acids，aa1-24)和一個(gè)跨膜區(qū)(amino acids，aa101-123)，所以使用E.coli表達(dá)orf10，表達(dá)的產(chǎn)物作為抗原用來(lái)制備抗體。本研究分為

2、兩部分：第一部分研究orf10基因編碼的囊膜蛋白的功能特性和定位；第二部分是選擇orf6基因研究了斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PCR-ELISA檢測(cè)方法以及該基因原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性。主要取得以下結(jié)果：
　　 1、成功地克隆了CCV的orf10基因。orf10有456bp，通過(guò)序列比對(duì)，和α皰疹病毒科其他已知的種類沒(méi)有很大的同源性。通過(guò)斑點(diǎn)雜交分析，估計(jì)的蛋白分子質(zhì)量接近35 kDa，比理論的分子質(zhì)量稍大(16 kDa)。這個(gè)差異有兩個(gè)原因

3、引起，一是轉(zhuǎn)譯后修飾，二是和別的囊膜蛋白產(chǎn)生相互作用。同時(shí)，完整粒子和囊膜在斑點(diǎn)雜交中的兩條帶存在2 kDa的差異，這可能是因?yàn)槎蜴I和/或糖基化作用，因?yàn)閛rf10被預(yù)測(cè)存在兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別在Asn64和Asn84。同樣在原核表達(dá)系統(tǒng)中，orf10基因表達(dá)的蛋白也顯示了同樣分子質(zhì)量，和預(yù)期的大小一致，同樣缺少翻譯后修飾。
　　 2、成功地確定了orf10基因在病毒粒子的位置。基于斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)和免疫電子顯微實(shí)驗(yàn)，基

4、因orf10編碼的蛋白被證明是一個(gè)囊膜蛋白。
　　 3、中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明CCV感染力降低，可能是因?yàn)槲蛔璎F(xiàn)象或者與抗體結(jié)合的封閉作用。這些結(jié)果都說(shuō)明orf10和病毒侵入有直接的關(guān)系，雖然準(zhǔn)確的機(jī)制還不是很清楚。因此，下一步的研究重點(diǎn)應(yīng)該是抗原表位的研究。
　　 4、通過(guò)斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)表明使用新型表達(dá)載體表達(dá)的orf6囊膜蛋白具有很好的免疫原性。
　　 5、根據(jù)CCV的orf6基因設(shè)計(jì)引物和捕獲探針，其中一條引物5