鋸緣青蟹呼腸孤病毒逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)方法、宿主范圍及克氏原螯蝦感染模型研究.pdf

1、鋸緣青蟹(Scylla serrata)是我國(guó)海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類的主要品種之一。鋸緣青蟹昏睡病及清水病給青蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，其病原為鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Scylla serrata reovrirus，簡(jiǎn)稱SSRV)，迄今該病尚無有效治療手段。
　　 本論文根據(jù)SSRV的RNA多聚酶基因序列設(shè)計(jì)引物，建立一種一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，簡(jiǎn)稱RT-PCR)，在一個(gè)反應(yīng)管中完成逆轉(zhuǎn)錄

2、和PCR擴(kuò)增兩個(gè)反應(yīng)，一次完成SSRV RT-PCR檢測(cè)，靈敏度達(dá)10-8μg純化SSRV dsRNA。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，減少污染和假陽性發(fā)生，為SSRV檢測(cè)、種苗篩查、宿主范圍調(diào)查提供了一種可靠的方法。
　　 利用一步法RT-PCR對(duì)海洋甲殼、軟體動(dòng)物等進(jìn)行了SSRV檢測(cè)，在三疣梭子蟹、脊尾白蝦、口蝦蛄、縊蟶、菲律賓蛤仔、溝螺、貽貝、泥蚶等組織中檢測(cè)到SSRV，其中三疣梭子蟹、菲律賓蛤仔、溝螺、泥蚶帶毒率較高

3、，分別為86.7％、90％、70％、90％；脊尾白蝦、口蝦蛄、貽貝、縊蟶帶毒率也分別達(dá)到38.1％、50％、50％、30％；未分類的飼料雜魚11個(gè)樣品中也有1個(gè)檢測(cè)到SSRV。提示養(yǎng)殖過程中應(yīng)將鋸緣青蟹與這些動(dòng)物隔離，切斷SSRV傳播途徑，避免以帶毒動(dòng)物作為飼料，消除傳染源，減少SSRV相關(guān)疾病發(fā)生。
　　 克氏原螯蝦(Procambarus clarki)和鋸緣青蟹同屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目，本論文從SSRV陽性鋸緣青蟹肝胰腺

4、組織制備SSRV懸液，經(jīng)第三尾節(jié)腹部肌肉內(nèi)接種健康克氏原螯蝦，每2日取接種克氏原螯蝦肝胰腺、鰓、肌肉和腸組織，以聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)、一步法RT-PCR、組織切片HE染色顯微觀察、超薄切片電鏡觀察等進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，接種克氏原螯蝦肝胰腺、鰓、肌肉和腸組織中不僅經(jīng)PAGE檢測(cè)到SSRV特征性dsRNA圖譜，一步法RT-PCR檢測(cè)到SSRV基因，組織切片經(jīng)