豬肝細(xì)胞黃嘌呤氧化還原酶代謝喹賽多的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、喹賽多是喹噁啉類抗菌促生長(zhǎng)類飼料添加劑。早先上市的喹噁啉類藥物如卡巴氧和喹乙醇在上世紀(jì)中后期曾廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)的各個(gè)環(huán)節(jié)，但隨后的毒理試驗(yàn)證明它們都具有明顯的三致作用，嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類健康。目前的毒理研究已經(jīng)表明喹賽多的無(wú)光敏、致畸、生殖和蓄積毒性，在豬和雞的安全性非常高，可成為新的喹嗯啉類替代藥。目前關(guān)于喹賽多代謝酶的研究還很少見(jiàn)，而藥物的毒理、藥理作用都與其原型藥物在機(jī)體內(nèi)的代謝及殘留息息相關(guān)，因此加強(qiáng)對(duì)喹賽多體內(nèi)代謝過(guò)程中相關(guān)酶

2、的研究就顯得刻不容緩了。喹賽多代謝關(guān)鍵酶的研究不僅有助于喹賽多作為一類新獸藥的申報(bào)，更能指導(dǎo)喹賽多在食品動(dòng)物中的合理使用，幫助制定合理的休藥期，從而避免了有害殘留的出現(xiàn)，為人類的食品健康保駕護(hù)航。
　　 黃嘌呤氧化還原酶(XOR)是含鉬類酶家族的一員，在動(dòng)物體內(nèi)各組織中分布廣泛，主要是參與哺乳動(dòng)物體內(nèi)次黃嘌呤代謝成黃嘌呤和黃嘌呤氧化代謝為尿酸的生理過(guò)程。XOR主要分布在組織細(xì)胞胞漿中，在肝細(xì)胞漿中展示了重要的氧化還原活性，是除P

3、450酶之外最重要的藥物代謝酶之一。XOR具有很強(qiáng)的還原代謝能力，主要參與了硝基、氮氧化物和硫氧化物等基團(tuán)的還原。由于喹賽多1位和4位的氮氧化物的還原產(chǎn)物都是喹賽多在動(dòng)物體內(nèi)代謝的主要代謝產(chǎn)物，已有的研究證明了喹賽多跟豬胞漿蛋白孵育后會(huì)發(fā)現(xiàn)代謝，推測(cè)XOR極有可能在喹賽多的脫氧還原代謝中扮演重要角色。
　　 本研究首先用XOR特異性抑制劑確定XOR是喹賽多的代謝酶，然后克隆豬肝細(xì)胞XOR基因，并選擇合適的體外表達(dá)系統(tǒng)對(duì)豬XOR進(jìn)

4、行重組表達(dá)，研究重組XOR的酶學(xué)性質(zhì)。為了研究XOR催化喹賽多代謝的機(jī)理，利用同源建模和分子對(duì)接技術(shù)確定XOR代謝喹賽多的關(guān)鍵氨基酸殘基，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，異源表達(dá)并鑒定突變體的代謝活性，展示關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其代謝能力的影響，并分析XOR結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
　　 1.豬XOR代謝喹賽多的驗(yàn)證
　　 差速離心法制豬肝細(xì)胞胞漿蛋白，與喹賽多進(jìn)行體外孵育，并用XOR特異性抑制劑作用，HPLC檢測(cè)代謝產(chǎn)物。
　　 體外代

5、謝試驗(yàn)可以明顯的看到豬肝細(xì)胞胞漿蛋白代謝喹賽多，XOR特異性抑制劑作用后可以看到明顯的抑制作用，說(shuō)明豬肝臟胞漿蛋白中的XOR可以代謝喹賽多。
　　 2.豬XOR基因的克隆、表達(dá)和活性鑒定
　　 用Trizole法提取肝細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，參照其它哺乳動(dòng)物同源性較高的序列設(shè)計(jì)引物，分兩段擴(kuò)增XOR基因，然后酶切連接獲得完整CDs序列。用pFastBac HTb載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)座

6、到桿粒中，然后轉(zhuǎn)染到桿狀病毒中，獲得含有XOR編碼序列的重組病毒。Sf9被桿狀病毒感染后表達(dá)XOR蛋白。Western blot驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果，蛋白膠灰度確定重組蛋白含量。測(cè)定XOR代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)(最大初速度Vmax、米氏常數(shù)Km和體外清除率CLint)。
　　 表達(dá)載體pFastBac HTb-XOR酶切結(jié)果證明目的基因克隆成功，XOR編碼序列測(cè)序后上傳到NCBI核苷酸庫(kù)中，序列號(hào)是JN896312.1。重組蛋白體外代謝結(jié)果表明

7、，重組蛋白是以活性形式存在于Sf9細(xì)胞中。重組XOR代謝喹賽多的Km值是代謝黃嘌呤的2.7倍，而Vmax只有后者的1/5，對(duì)黃嘌呤的Clint值是喹賽多的近15倍。說(shuō)明相對(duì)于喹賽多，豬XOR對(duì)黃嘌呤的結(jié)合能力更強(qiáng)，催化效率更高，代謝能力更強(qiáng)。
　　 3.豬XOR代謝喹賽多的關(guān)鍵氨基酸的確定
　　 利用分子生物學(xué)網(wǎng)站，分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，并根據(jù)牛XOR晶體結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行同源建模。將喹賽多作為配體，XOR作為受體進(jìn)行分子對(duì)接

8、，得到喹賽多代謝關(guān)鍵氨基酸殘基。
　　 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，豬XOR跟牛XOR的二級(jí)結(jié)構(gòu)十分接近。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明，該酶的功能區(qū)域保守性非常高，分別由含鐵硫中心的結(jié)構(gòu)域(20kDa)、含F(xiàn)AD的結(jié)構(gòu)域(40kDa)和含鉬輔助因子的結(jié)構(gòu)域(85kDa)三部分組成。同源建模結(jié)果可信程度很高，對(duì)模型評(píng)價(jià)DOPE Score是-157326.5625，Verify Score為616.831。RamachandranPlot圖結(jié)果顯

9、示，91.5%氨基酸都分布在藍(lán)色最適區(qū)域，5.7%氨基酸位于紫色可信區(qū)域，2.8%氨基酸位于可疑區(qū)域。將喹賽多與XOR模型對(duì)接后找到與喹賽多發(fā)生相互作用力的G47、N352、S360、R427、D430、D431、S1227和K1230八個(gè)氨基酸殘基。這八個(gè)氨基酸距離喹賽多都不超過(guò)4A，其中R427、D431、S1227和K1230與喹賽多形成了氫鍵結(jié)合，其余四個(gè)氨基酸形成了其它非共價(jià)鍵結(jié)合。分子對(duì)接模擬結(jié)果顯示，這些氨基酸殘基都與喹賽

10、多催化過(guò)程息息相關(guān)，能顯著改變XOR對(duì)喹賽多的代謝能力。
　　 4.點(diǎn)突變對(duì)XOR代謝喹賽多的影響
　　 構(gòu)建突變體表達(dá)載體，重組表達(dá)XOR突變體，并與喹賽多孵育評(píng)估突變對(duì)酶代謝喹賽多能力的影響。
　　 動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，XOR突變體代謝黃嘌呤時(shí)，D430H和D431A能增加CLint值，S360P、S1227A和K1230A能降低CLint值，說(shuō)明這些氨基酸殘基與黃嘌呤代謝能力關(guān)系密切。同時(shí)，這些位點(diǎn)的突變也

11、改變了酶對(duì)底物親和性和Vmax值，D431A能顯著增加Vmax，S360P、S1227A和K1230A對(duì)黃嘌呤親和性明顯降低，說(shuō)明這些位點(diǎn)與底物結(jié)合位點(diǎn)關(guān)系密切。XOR突變體代謝喹賽多結(jié)果顯示，XOR代謝喹賽多的能力不及代謝黃嘌呤1/10，R427E和D431A能增強(qiáng)CLint值，即能增強(qiáng)喹賽多代謝能力，S360P、D430H、S1227A和K1230A代謝喹賽多能力下降。R427E底物親和性明顯增強(qiáng)，S360P、S1227A和K123

12、0A的Km值明顯增大，說(shuō)明底物親和性減弱明顯，這些都說(shuō)明這些氨基酸殘基與喹賽多代謝作用相關(guān)。
　　 綜上所述，本研究在體外重組表達(dá)了喹賽多在豬體內(nèi)的代謝關(guān)鍵酶-黃嘌呤氧化還原酶(XOR)，并對(duì)該酶進(jìn)行了同源建模和分子對(duì)接模擬研究，確定了8個(gè)與喹賽多代謝相關(guān)的氨基酸。通過(guò)對(duì)這些氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變研究，一定程度上揭示了XOR代謝喹賽多的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及分子催化機(jī)制，為喹賽多在豬體內(nèi)的代謝提供了理論依據(jù)。此外，本研究建立的重組酶體外代