基于乙醇調(diào)控的Cre-lox重組系統(tǒng)在煙草中的功能驗證.pdf

1、為實現(xiàn)目的基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的適時表達,可通過在所要表達目的基因上游建立一個“基因開關(guān)”,構(gòu)建出可準確調(diào)控的基因表達系統(tǒng)而實現(xiàn)對基因表達的人工調(diào)控。Cre/lox重組系統(tǒng)由38.5 kD的Cre重組酶和34bp的fox特異性識別位點所構(gòu)成,該系統(tǒng)中的Cre重組酶能特異性識別并介導兩個lox識別位點之間的DNA序列發(fā)生刪除、倒位。Cre/lox系統(tǒng)重組功能在細菌、真菌、動物以及植物等生物中表現(xiàn)高效穩(wěn)定,被廣泛應用于植物轉(zhuǎn)基因及基因功能鑒

2、定等領(lǐng)域的研究。另外,化學誘導基因表達系統(tǒng)的出現(xiàn)為人工調(diào)控基因的表達提供了可能。包括四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)、類固醇激活系統(tǒng)、銅制劑誘導系統(tǒng)、乙醇誘導系統(tǒng)等均在植物中得到成功應用。其中的乙醇誘導基因表達系統(tǒng)從構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中發(fā)現(xiàn)的,該系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄因子alcR只有在與乙醇分子結(jié)合時才具有活性,可特異性作用于結(jié)構(gòu)基因alcA(酒精脫氫酶Ⅰ)的啟動子,激活其下游目標基因表達。研究顯示,該系統(tǒng)在誘導表達所需酒精濃度

3、范圍內(nèi)對植株生長幾乎沒有任何生理毒害作用,具有誘導方式靈活、方便,本底極低,在實驗室和大田都能有效使用的特點。本文根據(jù)上述兩套系統(tǒng)的特性,將Cre/lox重組系統(tǒng)和乙醇誘導表達系統(tǒng)相結(jié)合,將Cre重組酶基因的表達置于乙醇調(diào)控下,通過外源施加乙醇實現(xiàn)目的基因的人工表達調(diào)控,建立一條植物基因調(diào)控表達的新途徑。
　　 本文以煙草為研究對象,分別構(gòu)建兩個植物表達載體:一是乙醇調(diào)控的Cre重組酶表達載體,該載體中,轉(zhuǎn)錄因子alcR在35S

4、啟動子的控制下組成性表達,Cre重組酶基因在alcA啟動子的控制下表達。另外,構(gòu)建了一個GUS/Bar報告基因刪除激活表達載體,用于分析乙醇調(diào)控Cre重組酶的表達特點。該載體中35S啟動子下游是位于兩個同向lox位點之間的報告基因GUS,GUS報告基因下游是缺少啟動子的Bar除草劑抗性基因。將上述兩個載體用農(nóng)桿菌介導的共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株中的Cre重組酶一旦啟動表達,將導致使其中的Gus基因刪除,下游的BAR基因啟

5、動表達而獲得除草劑Basta的抗性。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用農(nóng)桿菌介導的葉盤共轉(zhuǎn)化法,通過潮霉素和卡拉霉素雙抗篩選,將PCA13a1cRCre和PCA23GusBar轉(zhuǎn)入煙草獲得大量轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2.隨機取37株在雙抗培養(yǎng)基(Kan和Hyg)正常生根的植株葉片進行除草劑Basta的抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在除草劑(PPT)濃度為10mg/L的分化培養(yǎng)基上,在37株植株中,編號為1、5、6、10、11、12、2

6、5、26、32、35和36號植株真葉葉盤在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L的分化培養(yǎng)基上不能分化愈傷組織及芽且葉盤逐漸變白,說明對應植株不具有除草劑Basta抗性,該類植株所占比例約為1/3。而其余共轉(zhuǎn)化植株真葉葉盤在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L分化培養(yǎng)基上能分化愈傷組織及芽,具有抗除草劑Basta的能力,該類植株所占比例約為2/3。Gus基因表達分析結(jié)果顯示,在除草劑Basta抗性分析中所有非抗性植株葉片(1、5、6、10

7、、11、12、25、26、32、35和36號植株)均被染成藍色,具有抗性的植株葉片除了3、4和23號植株外,均未染上藍色。而進一步的PCR.檢測結(jié)果表明不抗除草劑Basta且植株葉片染上藍色的植株均擴增出預期大小為1.8kb的Gus基因目標條帶,而抗除草劑以及葉片未染上藍色的植株均未擴增出目標條帶。
　　 3.對10、11、12以及32號Gus基因未被自動刪除植株進行外源乙醇誘導分析發(fā)現(xiàn),在乙醇誘導前,葉片能被染成藍色,表明Gu

8、s基因仍存在于植株中。用60ml4.0%濃度乙醇灌根處理48h后,對應植株葉片在含除草劑(PPT)濃度為10mg/L培養(yǎng)基上保持綠色,對除草劑具有抗性。進一步對誘導后植株的葉片進行鐋的表達分析,結(jié)果顯示,四株植株葉片均未被染成藍色,顯示Gus基因已經(jīng)被刪除。
　　 4.自動誘導表達轉(zhuǎn)基因植株alcR與Cre基因在未添加乙醇誘導情況下的RT-PCR結(jié)果顯示,自動誘導啟動轉(zhuǎn)基因植株的alcR轉(zhuǎn)錄因子均正常表達的同時伴隨Cre基因的表

9、達。顯示該乙醇誘導Cre重組系統(tǒng)在某些轉(zhuǎn)基因植株中確實存在背景表達現(xiàn)象。
　　 5.自動誘導表達和人工誘導表達轉(zhuǎn)基因植株的半定量PCR以及定量PCR結(jié)果顯示,外源乙醇處理后,自動誘導表達轉(zhuǎn)基因植株的Cre表達量隨誘導時間的增加,表現(xiàn)出先增長后降低的趨勢,處理后24h時達到最高峰;人工誘導表達轉(zhuǎn)基因植株的Cre表達量隨誘導時間的增加,表現(xiàn)出降低一增長一降低的趨勢,48h時達到最高峰,而24h表達量卻最低。但Cre基因在自動誘導表達