蘇云金桿菌嵌合殺蟲蛋白的構(gòu)建與毒性分析.pdf

1、作為重要的殺蟲微生物，蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt.)被越來越多的應(yīng)用在生物防治與轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，但是當(dāng)今生物殺蟲劑面臨的一個(gè)最為重要的問題是農(nóng)業(yè)害蟲日益增長(zhǎng)的抗藥性。因此，開發(fā)出更多蘇云金芽胞桿菌新型殺蟲基因和尋找減緩昆蟲抗性的方法，成為當(dāng)今生物防治和轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative Insecticidal Protein，簡(jiǎn)稱VIPs)被譽(yù)為

2、第二代生物殺蟲劑，與傳統(tǒng)上應(yīng)用最為廣泛的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Protein，簡(jiǎn)稱ICPs)相比，具有完全不同殺蟲機(jī)理和殺蟲譜。目前單獨(dú)的VIPs和單獨(dú)的ICPs轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)培育成功。然而，對(duì)于VIPs和ICPs兩種蛋白協(xié)同使用的研究報(bào)道較少。鑒于此，本論文利用本室保存的一種密碼子優(yōu)化后的營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip3Aa7與其余幾種優(yōu)化后的cry殺蟲晶體蛋白基因構(gòu)建了幾種新型的嵌合殺蟲蛋白基因，并研究了

3、殺蟲活性，主要結(jié)果如下：
　　 1.Bt.嵌合殺蟲蛋白植物表達(dá)載體及pCPANEK通用植物表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 利用增強(qiáng)子翻倍的CaMV35S啟動(dòng)子，TmvΩ和Kazak翻譯增強(qiáng)序列以及PolyA識(shí)別剪切序列，PolyA尾序列以及Nos強(qiáng)終止子序列為表達(dá)元件，植物表達(dá)載體pCAMBIA2300為骨架構(gòu)建出pCPANC1C，pCPANC2A，pCPANC9C單價(jià)植物表達(dá)載體，以及pCPANV3AC1C，pCPANV3AC

4、2A，pCPANV3AC9C三種雙價(jià)嵌合蛋白植物表達(dá)載體。
　　 利用上述表達(dá)元件和pCAMBIA2300載體，人工構(gòu)建出一個(gè)通用性的植物表達(dá)載體pCPANEK，特點(diǎn)是在5’和3’表達(dá)框中間添加一段腸激酶切點(diǎn)(EK site)，可方便的直接構(gòu)建雙價(jià)嵌合蛋白，免除了分步克隆操作的繁瑣。
　　 2.嵌合殺蟲蛋白V3AC9C具有高效的殺蟲活性，其毒力增加主要來自溶解度提高。
　　 利用vip3Aa7與CrylCa，Cr

5、y2Aa，Cry9Ca等基因發(fā)明出一種嵌合蛋白的構(gòu)建方法，將vip3Aa7基因置于5’端，保留N-半段cry基因置于3’端。構(gòu)建出嵌合蛋白和各個(gè)單價(jià)殺蟲蛋白使用帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中重組表達(dá)。結(jié)果表明：
　　 絕大部分蛋白在BL21中得到正確的表達(dá)。生物測(cè)定表明，使用Vip3Aa7和N-半段的Cry9Ca構(gòu)建出的嵌合蛋白V3AC9C對(duì)小菜蛾具有非常高的毒力，半致

6、死濃度(LC50)為0.322μg/mL，表達(dá)量為單價(jià)的N-半段Cry9Ca的61.3%。使用胰蛋白酶對(duì)V3AC9C進(jìn)行切割激活，表明嵌合蛋白能被正確的切割成單獨(dú)的Vip3Aa7的62kDa核心毒性片段和Cry9Ca的55kDa最終降解片段。
　　 將Vip3Aa7和N-半段Cry9Ca按照1:1質(zhì)量比混合后作為對(duì)照，測(cè)定嵌合蛋白V3AC9C協(xié)同作用。發(fā)現(xiàn)V3AC9C的毒力甚至要高出混合毒素3.2倍。計(jì)算V3AC9C中Vip3A

7、a7和Cry9Ca的協(xié)同系數(shù)高達(dá)4.7，而混合毒素中的協(xié)同系數(shù)僅有1.5。溶解度分析和顯微鏡檢測(cè)表明，在嵌合蛋白中Vip3Aa7可以幫助Cry9Ca溶解在堿性緩沖體系中，并證明嵌合蛋白V3AC9C的毒力增加主要來自于提高的溶解度。
　　 本次試驗(yàn)首次將Vip3A類蛋白與Cry類蛋白構(gòu)建出嵌合蛋白，并且證明此種構(gòu)建方式的可行性。構(gòu)建出的嵌合蛋白V3AC9C高毒的特性和低表達(dá)量，使其可能成為一種非常有潛力的轉(zhuǎn)基因材料。
　　

8、 3.蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa7半胱氨酸突變體的研究。
　　 Bt.殺蟲蛋白的毒性跟溶解度密切相關(guān)。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)Vip3Aa7蛋白含有三個(gè)非常保守的半胱氨酸殘基(Cys292，Cys401，Cys507)。為了研究這三個(gè)半胱氨酸殘基對(duì)毒性的影響，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將這3個(gè)半胱氨酸殘基替換成絲氨酸，以期待能夠增加毒性。三個(gè)突變體表達(dá)后測(cè)定溶解度均比野生型有了一定的提高。但是生測(cè)結(jié)果表明，突變體毒力并未提高，而且C