水稻C2H2型鋅指蛋白ZFP182和ZFP36在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護中的功能分析.pdf

1、植物特別是作物對非生物逆境（干旱、冷害、高鹽環(huán)境等）的適應(yīng)性對于作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有著非常重要的影響，干旱是植物逆境最普遍的形式，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。植物響應(yīng)干旱脅迫的一種重要反應(yīng)是積累植物激素脫落酸(abscisic acid,ABA)。水分脅迫下所積累的ABA能增加植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和上調(diào)抗氧化防護系統(tǒng)的活性，增強植物對水分脅迫的耐性。而在這一信號網(wǎng)絡(luò)中，一些轉(zhuǎn)錄因子如MYB、WRKY、熱激因子和多種類型鋅指蛋白的含量增加，

2、它們共同參與維持ROS的穩(wěn)定含量。因而認(rèn)為這些轉(zhuǎn)錄因子家族在植物對逆境的應(yīng)答過程中起著非常重要的調(diào)控作用。但鋅指蛋白在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護中的作用機理，尤其與H2O2、MAPK、NADPH氧化酶等ABA信號途徑中的主要組分的關(guān)系并不清楚。
　　 本研究從水稻中分離參與ABA、H2O2應(yīng)答反應(yīng)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子著手，通過原生質(zhì)體瞬時表達和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子基因過表達或者沉默，通過對比轉(zhuǎn)基因與野生型植株抗氧化防護酶、NAD

3、PH氧化酶以及MAPK的基因表達及酶活，深入探討其在水稻耐逆性中的作用機理，對提高水稻抗逆性的遺傳育種改良有重要的理論指導(dǎo)意義。主要研究結(jié)果如下:
　　 利用生物信息學(xué)和RT-PCR的方法從水稻幼苗的葉片中分離出兩個鋅指蛋白基因ZFP182和ZFP36，分別與擬南芥ZAT12和ZAT10有較高的同源性。其編碼產(chǎn)物都含有兩個典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，ZFP182編碼產(chǎn)物為170個氨基酸殘基，分子量為18.215 kDa，而ZFP3

4、6編碼產(chǎn)物為220個氨基酸，分子量為22.804 kDa。通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)，這兩個鋅指蛋白基因均定位于細胞核中。熒光定量RT-PCR分析表明:ABA和H2O2處理后，水稻葉片中ZFP18和ZFP36基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比，出現(xiàn)雙階段快速、瞬時的上調(diào)。H2O2清除劑(DMTU)的預(yù)處理能有效抑制ABA誘導(dǎo)的ZFP182和ZFP36基因的轉(zhuǎn)錄。NO也能上調(diào)ZFP182和ZFP36基因的表達;這些結(jié)果提示，ABA、H2O2和NO均能誘

5、導(dǎo)ZFP182和ZFP36基因的轉(zhuǎn)錄，而且ABA誘導(dǎo)水稻鋅指蛋白基因表達增強是通過ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2來起作用的。
　　 為了進一步研究ZFP182和ZFP36的功能，本研究分別構(gòu)建了ZFP182和ZFP36基因的過量表達(sense)、反義抑制(antisense)和RNA干涉（sense/antisense，dsRNA）的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，成功獲得ZFP182的RNA干擾植株;ZFP36

6、的過量表達和反義抑制以及RNA干擾的植株。分別以轉(zhuǎn)基因水稻F1代和野生型水稻為材料，外源ABA處理可以提高細胞內(nèi)SOD和APX的活性，與野生型相比，RNA干擾及反義抑制的轉(zhuǎn)基因植株的SOD和APX的活性顯著降低。通過原生質(zhì)體瞬時表達體系，我們也發(fā)現(xiàn)過表達ZFP182和ZFP36基因可以明顯提高SOD和APX酶的活性，而干擾這兩個鋅指蛋白基因，SOD和APX的活性顯著下降。經(jīng)ABA處理后，SOD和APX的活性均略有上升，實驗結(jié)果與以轉(zhuǎn)基因

7、植株為材料的結(jié)果完全吻合，充分說明了ZFP182和ZFP36基因確實參與了ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護反應(yīng)，而且在其中扮演了重要的角色，對植物增強抗氧化防護，提高脅迫耐性具有重要意義。
　　 真核生物中的MAPK級聯(lián)系統(tǒng)在外源刺激信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)應(yīng)答受體/感應(yīng)器的下游過程中起樞紐作用。植物ABA信號途徑中也有MAPK級聯(lián)系統(tǒng)的參與。
　　 本研究以水稻幼苗葉片為材料，采用藥理學(xué)方法和熒光定量RT-PCR技術(shù)研究了MAPK和ZFP1

8、82和ZFP36基因轉(zhuǎn)錄在ABA信號途徑之間的關(guān)系。MAPKK抑制劑（PD98059和U0126）的預(yù)處理能有效抑制ABA誘導(dǎo)的ZFP182和ZFP36基因的轉(zhuǎn)錄。在水稻原生質(zhì)體中，ABA處理能夠上調(diào)ZFP18和ZFP36的表達。利用dsRNA技術(shù)，分別將OsMPK1和OsMPK5基因（分別與AtMPK6和AtMPK3同源）沉默，ABA對ZFP182和ZFP36基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)被阻斷。而利用dsRNA技術(shù)或者RNAi突變體分別使ZFP18

9、2和ZFP36基因沉默，OsMPK1和OsMPK5基因的表達不受影響;說明在ABA信號途徑中，OsMPKl/OsMPK5和ZFP36/ZFP182呈現(xiàn)出一種直線關(guān)系，即OsMPK1和OsMPK5作為ZFP182和ZFP36的上游因子發(fā)揮作用。
　　 本實驗室已有的研究結(jié)果顯示ABA及H2O2均可以誘導(dǎo)OsDMI3基因表達，提示這一激酶可能參與干旱與氧化脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，這一激酶在植物對脅迫反應(yīng)中涉及的下游元件還不清楚。OsD

10、MI3與鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系更是未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣通道阻斷劑EGTA、LaCl3，CaM拮抗劑TFP、W7和CCaMK抑制劑KN-93的預(yù)處理能有效抑制ABA誘導(dǎo)的OsZF182和OsZF36基因的轉(zhuǎn)錄。通過原生質(zhì)體瞬時表達及dsRNA技術(shù)，干擾OsDMI3基因的表達，能有效的阻斷ABA對鋅指蛋白基因ZFP182和ZFP36的誘導(dǎo)，暗示在ABA信號途徑中，OsDMI3位于ZFP182和ZFP36的上游，調(diào)控這兩個鋅指蛋白基因的表

11、達。有意思的是，利用原生質(zhì)體瞬時沉默技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分別干擾ZFP182和ZFP36基因的表達，可以顯著降低ABA誘導(dǎo)的OsDMI3基因的轉(zhuǎn)錄和活性，暗示ZFP182和ZFP36基因又可以調(diào)控OsDMI3基因的表達。上述研究結(jié)果表明，在ABA信號通路中，OsDMI3和ZFP182/ZFP36之間可能存在一個交叉對話的機制:OsDMI3作為上游因子調(diào)控ZFP182和ZFP36基因的表達，而鋅指蛋白ZFP182和ZFP36作為轉(zhuǎn)錄因子，可

12、能通過直接作用于OsDMI3的啟動子區(qū)域或者通過作用于其他的一些激酶或者因子間接的對OsDMI3起調(diào)控作用。具體機制還有待于進一步深入的研究。
　　 本實驗室以往以玉米葉片作為材料的實驗闡明，在ABA信號途經(jīng)中，NADPH、H2O2和MAPK之間存在一個正反饋調(diào)節(jié)機制:即ABA誘導(dǎo)ZmrbohA-D基因的轉(zhuǎn)錄，增加RBOH的活性，誘導(dǎo)質(zhì)外體H2O2產(chǎn)生，活化MAPK，繼而通過激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子從而再次激活Rboh基因的表達，增加R

13、BOH的活性，導(dǎo)至H2O2的進一步產(chǎn)生，形成一個RBOH介導(dǎo)的ROS放大過程。但是，對于ZFP182和ZFP36是否參與這個正反饋調(diào)節(jié)過程并不清楚。本研究用NADPH的抑制劑(DPI)預(yù)處理能有效抑制ABA誘導(dǎo)的ZFP182和ZFP36基因的轉(zhuǎn)錄，說明在ABA信號系統(tǒng)中，Osrbohs基因位于ZFP182和ZFP36基因的上游。利用水稻原生質(zhì)體瞬時表達和dsRNA技術(shù)干擾ZFP182或ZFP36基因，對ABA信號相關(guān)的OsrbohB和O