大口黑鱸EST數(shù)據(jù)庫分析及與生長相關的分子標記篩選.pdf

1、大口黑鱸是遺傳研究和基因信息比較缺乏的物種。目前大口黑鱸可利用的有效標記數(shù)量有限,建立表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫,為SSR和SNP的開發(fā)提供了新的途徑。本研究應用高通量羅氏454測序技術對大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種進行轉錄組測序并建立ESTs數(shù)據(jù)庫,并以文庫為基礎進行大口黑鱸SSR和SNP的篩選及生長性狀的關聯(lián)分析,主要研究內容和結果如下:
　　1、大口黑鱸兩個亞種EST數(shù)據(jù)庫的構建和分析
　　應用新一代高通量測序技術

2、Roche454對大口黑鱸北方亞種(M. salmoides salmoides)和佛羅里達亞種(M. salmoides floridanus)進行轉錄組測序并建立ESTs數(shù)據(jù)庫,結果得到北方亞種ESTs序列468671條,佛羅里達亞種ESTs序列332322條,兩亞種ESTs序列的平均長度分別為306.5bp和304.4bp。將得到的高質量序列進行拼接,大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種共得到contig序列總數(shù)分別為42056條和35

3、743條,平均長度分別是612.6bp和588.2bp。將大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種的數(shù)據(jù)庫合并,通過與蛋白數(shù)據(jù)庫比對后,共78938條EST序列被注釋,根據(jù)Gene Ontology(GO)信息,對序列按照分子功能、細胞組成、生物學過程進行分類。通過對大口黑鱸合并的EST庫信息進行大通量SSR和SNP位點的發(fā)掘,發(fā)現(xiàn)了含SSRs和SNPs的序列分別是25469和8547條。從EST數(shù)據(jù)庫中隨機選取75條contigs進行北方亞種和

4、佛羅里達亞種的序列比較,結果表明兩個亞種EST序列同源性為99.2％。
　　2、大口黑鱸EST-SSR標記的開發(fā)
　　選取133條SSRs序列并設計引物,其中15對能夠擴增出帶型清晰且有多態(tài)性的譜帶。用這15對引物分析大口黑鱸微衛(wèi)星的多態(tài)性,結果表明:每個位點檢測到的等位基因數(shù)為2-5個,平均等位基因是2.533個,觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的范圍分別為0.150-0.857(平均0.480)和0.262-0.7

5、39(平均0.550),平均多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.261-0.740(平均0.384)。Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗結果表明15個位點中只有一個位點(Contig44566)嚴重偏離了平衡。
　　3、大口黑鱸SNP的篩選及載脂蛋白部分序列上SNP多態(tài)性與生長相關的分析
　　根據(jù)大口黑鱸EST庫中的載脂蛋白、激活素、鋅指蛋白等生長代謝基因的10個片段設計引物擴增,結果共得到了14個SNP位點。為進一步

6、研究其中載脂蛋白(載脂蛋白A1、載脂蛋白A4和載脂蛋白C1)基因上的SNP位點,將其在另外一個群體中進行驗證,結果表明大口黑鱸載脂蛋白A1基因上有1個顛換SNP位點:A+489C;載脂蛋白A4上篩到1個轉換SNP位點:A+633T;載脂蛋白C1上篩到2個顛換SNP位點:A+24G和A+75C。采用SnapShot的方法分別對同一群體的159尾大口黑鱸的這4個位點進行檢測和分型,統(tǒng)計基因型頻率,并利用一般線性模型分析4個SNPs位點與大口