梅花鹿激素及其受體基因變異對產(chǎn)茸量的調(diào)控效應(yīng)研究.pdf

1、影響梅花鹿產(chǎn)茸量的因素很多，如何克服不良影響因素、以提高產(chǎn)茸量一直是人們追求的目標(biāo)。了解鹿茸生長發(fā)育調(diào)控規(guī)律，可以促進(jìn)提高鹿茸產(chǎn)量的新技術(shù)發(fā)展；開發(fā)操作簡便、結(jié)果可靠的選種方法，培育產(chǎn)茸量高的新品種，是提高梅花鹿產(chǎn)茸量的基本手段。鑒于梅花鹿養(yǎng)殖中目前存在的選種方法落后的狀況，本研究以湖北白鹿春實業(yè)有限公司梅花鹿養(yǎng)殖場(n=302)和吉林省東豐縣東豐藥業(yè)股份有限公司養(yǎng)鹿場人工養(yǎng)殖梅花鹿(n=234)種群為研究對象，通過分析生長激素(GH)

2、、褪黑激素Ⅰ型受體a亞型(MTNR1A)基因和雄激素受體(AR)基因的單核苷酸多態(tài)性及其與產(chǎn)茸性狀的關(guān)系，尋找SNP位點，為建立梅花鹿產(chǎn)茸性狀分子標(biāo)記輔助選擇方法奠定基礎(chǔ)；同時，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對已擴(kuò)增得到的梅花鹿褪黑素受體基因進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析，為闡明鹿茸生長發(fā)育調(diào)控規(guī)律、開發(fā)提高產(chǎn)茸量的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.梅花鹿激素及其受體基因多態(tài)性與產(chǎn)茸量的關(guān)系
　　 (1)GH基因多態(tài)性及其與產(chǎn)茸

3、量的關(guān)系：在2個梅花鹿種群中，發(fā)現(xiàn)GH基因3個突變位點，并被GeneBank收錄，即A176-G176突變(登錄號：GQ438251.1)，A45-G45突變和C139-T139突變(登錄號：GQ438253.1)，A176-G176突變導(dǎo)致StuI限制性內(nèi)切酶位點的改變。利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型，分析基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩個梅花鹿種群各基因型之間的產(chǎn)茸估測值差異不顯著(P>0.05)；A45-G45

4、突變未引起限制性內(nèi)切酶位點的改變，因此用AS-PCR引物，進(jìn)行基因分型。而后將基因的多態(tài)性與產(chǎn)茸估測值之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)兩個梅花鹿種群各基因型的產(chǎn)茸估測值都沒有差異(P>0.05)；C139-T139突變也未引起限制性內(nèi)切酶位點的改變，用AS-PCR引物進(jìn)行基因分型，并分析基因多態(tài)性與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在五三梅花鹿種群中各基因型之間的產(chǎn)茸估測值沒有差異(P>0.05)，而在東豐梅花鹿種群中，CT基因型和CC基因型的產(chǎn)茸量估測

5、值顯著高于TT基因型(P<0.05)。
　　 (2)MINR1A基因多態(tài)性及其與產(chǎn)茸量的關(guān)系：在2個梅花鹿種群中，MTNR1A基因外顯子2出現(xiàn)3個突變，測定其分子結(jié)構(gòu)后提交并被GeneBank收錄，即C518-T518、G629-C629和C635-T635突變(登錄號：JN038179)。C518-T518突變引起Ecol881酶切位點的改變，利用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型，然后分析基因多態(tài)性及其與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，

6、發(fā)現(xiàn)在兩個梅花鹿種群中各基因型之間的產(chǎn)茸估測值都沒有差異(P>0.05)；在G629-C629處突變能引起Mval酶切位點的改變。利用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型，并分析基因多態(tài)性與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在五三梅花鹿種群中，CC基因型的產(chǎn)茸估測值顯著高于GC基因型(P<0.05)，GC基因型的產(chǎn)茸估測值顯著高于GG基因型(P<0.05)，而CC基因型與GC基因型之間沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異水平(P>0.05)。C635-T635突變未

7、引起限制性內(nèi)切酶位點的改變，所以用AS-PCR引物進(jìn)行基因分型，然后分析基因多態(tài)性與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在兩個梅花鹿種群的各基因型之間，產(chǎn)茸估測值都沒有差異(P>0.05)。
　　 (3)AR基因多態(tài)性及其與產(chǎn)茸量的關(guān)系：在2個梅花鹿種群中，AR基因存在2個突變位點，測序后提交并被GeneBank收錄，外顯子3的C75-T75和外顯子8的C256-T256(登錄號：JF719040)位點。C75-T75突變引起RsaⅠ酶切

8、位點改變，利用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型，然后分析基因多態(tài)性與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在五三梅花鹿群體中，CT基因型的產(chǎn)茸量估測值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型與TT基因型以及TT基因型與CC基因型之間沒有差異(P>0.05)。在東豐梅花鹿群體中，CT基因型的產(chǎn)茸量估測值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型與TT基因型以及TT基因型與CC基因型之間沒有差異(P>0.05)；C256-T256突變通過SSCP

9、-PAGE技術(shù)進(jìn)行基因分型，分析基因多態(tài)性及其與產(chǎn)茸估測值之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)該位點僅在五三梅花鹿種群中存在多態(tài)性，但各基因型之間的產(chǎn)茸估測值沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2.梅花鹿雄激素受體和褪黑素受體結(jié)構(gòu)分析與功能預(yù)測
　　 (1)應(yīng)用Clustal W多序列比對模式對MTNR1A氨基酸序列與9種其他脊椎動物比對，發(fā)現(xiàn)梅花鹿中該基因編碼的氨基酸序列與其他動物一樣保守，在MTNR1A編碼序列864位的核苷酸由

10、G突變?yōu)镃，導(dǎo)致氨基酸突變。比較G突變前、后所編碼蛋白的理化特性，證明該蛋白非常穩(wěn)定。
　　 (2)分析梅花鹿MTNR1A基因的分子進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)MTNR1A基因的進(jìn)化與其他物種的進(jìn)化非常一致，梅花鹿和牛屬于反芻動物，故分歧時間晚于鳥類前于高等動物，說明在GPCR進(jìn)化歷程中，梅花鹿同樣遵循物種分化的規(guī)律。
　　 (3)應(yīng)用SMART蛋白功能區(qū)域預(yù)測軟件，預(yù)測MTNR1A編碼序列有7個跨膜區(qū)段，為7次跨膜蛋白，在864bp位

11、點的R288S突變體位于NRF蛋白保守功能區(qū)域。應(yīng)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和Hidden Markov models模型，得到了兩種可能的信號肽剪接位點，分別是33-34位和61-62位。
　　 (4)分析MTNR1A基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)864bp處唯一引起氨基酸改變的突變，位于第6次跨膜和第7次跨膜之間的細(xì)胞外信號分子結(jié)合位點區(qū)域的LOOP區(qū)，該區(qū)域暴露于細(xì)胞膜之外，是可能參與下游信號分子傳導(dǎo)的功能區(qū)。
　　 (5)

12、分析MTNR1A家族成員，發(fā)現(xiàn)其屬于GPCR家族A成員，與視紫紅質(zhì)有55%的同源性，突變氨基酸位于細(xì)胞外的袢環(huán)位置，可能對褪黑素配體的結(jié)合以及激活受體密切相關(guān)，說明梅花鹿的褪黑素受體可能存在物種特異性的結(jié)合及其激活機(jī)制，提示該位點可能是活性位點。
　　 (6)采用IPA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)MTNR1A除了與其配體褪黑素結(jié)合外，還與眾多基因、轉(zhuǎn)錄因子、接頭蛋白等相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MTNR1A是一類重要的GPCR受體，