花生組織培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化研究.pdf

1、花生是一種優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)作物。利用生物技術(shù)方法在花生中導(dǎo)入外源優(yōu)良基因，是改良花生品質(zhì)的有效方法，組織培養(yǎng)即是這樣一種高效生物技術(shù)手段。利用組織培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建花生高頻植株再生體系是花生育種的關(guān)鍵，但由于植株再生率低、取材具有季節(jié)限制，并且花生的離體培養(yǎng)具有較大的基因型依賴性，品種間再生能力差別較大等多種因素的制約，很難獲得高效、穩(wěn)定、連續(xù)的再生植株。探索和完善高頻率植株再生體系具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 本研究以4個花生品種

2、(普通型的大花生8130，珍珠豆型的小花生花育20，中間型的花育14和花育16)為目標(biāo)，從滅菌方式的選擇、不同外植體的選擇、不定芽誘導(dǎo)、抗生素抑制細(xì)菌污染、壯苗、生根培養(yǎng)及煉苗移栽等多環(huán)節(jié)研究入手，以優(yōu)化花生植株再生體系為目的，篩選及優(yōu)化花生高頻率植株再生體系的構(gòu)建條件，建立和優(yōu)化了花生的高頻率植株再生體系，為花生遺傳轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。以期為研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1.花生種子滅菌適宜方法為：無菌條件下，用75％酒精浸0.

3、5-1min，在1%次氯酸鈉中浸泡10min，進(jìn)行表面消毒，最后用無菌水洗滌3-4次，每次3-5min。這種方法滅菌效果好，對種子傷害少，負(fù)面影響也少。
　　 2.不定芽誘導(dǎo)
　　 2.1不同基因型誘導(dǎo)不定芽：不同基因型均能成功誘導(dǎo)不定芽。在基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基B3N1中花生品種魯花14和花育20的不定芽發(fā)生頻率較高，分別為76.65%和75.81%?；ㄓ?6和8130的不定芽發(fā)生頻率較低，分別為52.2%和45.80%。

4、r>　　 2.2不同外植體誘導(dǎo)不定芽：研究發(fā)現(xiàn)花生誘導(dǎo)不定芽的最佳外植體為萌發(fā)6d的胚小葉，其誘導(dǎo)生芽率明顯高于其它外植體，不定芽誘導(dǎo)率為75%。萌發(fā)3d的胚小葉，長短只有1-2mm，不易切割，并且容易出現(xiàn)細(xì)菌污染和褐化，不定芽誘導(dǎo)率為72.5％；萌發(fā)9d的胚小葉，葉片逐漸張開，芽分化能力逐漸降低，不定芽誘導(dǎo)率為68.75％。上胚軸、下胚軸、子葉也誘導(dǎo)出少量的不定芽，其誘導(dǎo)率分別為3.75％、5％、7.5％。
　　 2.3不同

5、激素配比培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響：基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基B3N1中AgNO3濃度2mg/L的處理萌發(fā)6d的花育20胚小葉不定芽誘導(dǎo)率最高達(dá)85%，玻璃化現(xiàn)象最低只有22.86%。誘導(dǎo)培養(yǎng)基N1在4個基因型中誘導(dǎo)頻率都較高，普遍達(dá)到80%以上，在N1培養(yǎng)基中花育20不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)89.2%。不同濃度NAA和TDZ和6-BA處理的T系列的培養(yǎng)基在花育20胚小葉的誘導(dǎo)試驗(yàn)中表現(xiàn)一般，最高誘導(dǎo)率只有73.91%，比N1培養(yǎng)基表現(xiàn)要差。說明T系

6、列不是花育20胚小葉的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
　　 3.再生植株的壯苗、生根培養(yǎng)
　　 3.1不定芽分化培養(yǎng)：分化培養(yǎng)基C6(5mg/L6-BA、4mg/LGA)中不定芽分化率最高，達(dá)86.67％。可作為花育20不定芽伸長的最佳分化培養(yǎng)基。
　　 3.2多效唑在壯苗及生根培養(yǎng)中的應(yīng)用：多效唑可以有效地抑制株高，形成壯苗，有效解決組培苗出現(xiàn)的苗莖細(xì)長和瘦弱等問題。當(dāng)多效唑濃度是0.5mg/L時，是合適的壯苗濃度，當(dāng)多效唑

7、濃度過大，組培苗表現(xiàn)生長健壯，植株矮化嚴(yán)重。反而不利于壯苗。在花生生根培養(yǎng)基中，附加0.2mg/L多效唑效果為最好，根系發(fā)達(dá)，移栽苗成活率高。生根培養(yǎng)基中多效唑濃度超過0.2mg/L時，反而降低繁殖系數(shù)和成活率。因此，在花生組培快繁過程中，應(yīng)兼顧試管苗健壯、繁殖系數(shù)高和移栽成活率高幾個方面。
　　 3.3抗生素對細(xì)菌的抑制效應(yīng)：在花生組織培養(yǎng)苗繼代培養(yǎng)基中添加一定濃度的醫(yī)用抗生素可有效抑制細(xì)菌對培養(yǎng)基的侵染。在本實(shí)驗(yàn)所選用的5種

8、抗生素中，羧卞青霉素對污染的組培苗抑菌效果最顯著，60mg/L就能達(dá)到抑菌率100％，并且對組培苗的正常生長無顯著影響，在花生組培中可以選用。而添加卡那霉素和利福平的處理，組培苗的葉綠素的合成明顯受到影響，不建議選用。
　　 3.4生根培養(yǎng)：在IR2生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生根效果較好，生根率高，高達(dá)95.04％，根數(shù)多且長，生根部位愈傷組織小。移栽后成活率也最高，達(dá)47.31％。
　　 4.煉苗移栽
　　 不同基質(zhì)移栽