西瓜細菌性果斑病菌的GFP基因標記及在西瓜體內(nèi)的定殖.pdf

1、本研究通過XbaI和HindⅢ雙酶切PS4GFP質(zhì)粒，回收獲得GFP片段，將GFP片段連接到同樣雙酶切回收的T-gfp質(zhì)粒的大片段上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒T-GFP2011；再通過EcoRI和HindIII雙酶切T-GFP2011質(zhì)粒，將回收得到的GFP片段連接到同樣雙酶切質(zhì)粒PKK223-3大片段上，構(gòu)建了能在西瓜細菌性果斑病菌中表達綠色熒光蛋白的載體PKK-GFP，且具有Amp抗性。
　　研究還對果斑病菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化條件進

2、行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用NB培養(yǎng)基，在28℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌液濃度OD600=0.3-0.4，利用0.1M預(yù)冷的含MgCl2的CaCl2處理所制備感受態(tài)細胞，其轉(zhuǎn)化效率最高，并成功將GFP基因標記了西瓜細菌性果斑病A13菌株。標記后菌株的生物學(xué)測定表明，其與野生菌株生長趨勢一致，但提前2h進入對數(shù)生長期；遺傳穩(wěn)定性較高，傳代培養(yǎng)第15代時Amp抗性保持率100%，熒光保持率達到98%；具有較強的致病能力，與野生菌株沒有顯著差異。
　

3、　利用GFP基因標記好的菌株A13-PK-GFP進行定殖研究，結(jié)果表明，灌根接菌后，取樣鏡檢可在西瓜的側(cè)根周圍觀察到標記細菌富集、吸附，后侵入側(cè)根表層，進入內(nèi)皮層和維管束，沿維管束向上經(jīng)主根、根莖交界、莖和葉轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要定殖在維管束、葉柄以及氣孔周圍；子葉噴霧接種后，取樣觀察，首先在子葉、子葉上莖和新葉中觀察到標記細菌，而子葉下莖菌量較少，根中沒有觀察到標記細菌，說明標記細菌在西瓜體內(nèi)主要由下至上轉(zhuǎn)導(dǎo)；另外，定殖動態(tài)研究結(jié)果表明標記細菌主