粳稻廣譜抗稻瘟病基因Pi-hkl的精細(xì)定位及燦稻地方品種抗瘟性關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上超過(guò)半數(shù)的人口以大米為主食。由子囊真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是一種世界性的水稻病害。由于其危害面積和危害程度日趨嚴(yán)重，已成為水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重障礙。全球每年因稻瘟病造成的產(chǎn)量損失達(dá)11-30％，損失的糧食足以養(yǎng)活6，000萬(wàn)人口。實(shí)踐證明，在稻瘟病防治措施中，利用抗病基因培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、安全且有效的措施。但是，由于稻瘟病菌小種的遺傳復(fù)雜性及易變性，大多數(shù)抗病品種推廣

2、種植3-5年后，抗性就會(huì)減弱或喪失。因此，研究者需要不斷地從水稻種質(zhì)資源，特別是野生稻資源和地方品種中，發(fā)掘、鑒定優(yōu)異的廣譜抗性基因或抗性QTL，將這些廣譜抗性基因?qū)氲剿酒贩N中，或通過(guò)基因累加手段實(shí)現(xiàn)多個(gè)部分抗性基因或QTL的聚合，使抗病品種具有更廣譜持久的抗性。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)已經(jīng)鑒定的位于水稻第11染色體長(zhǎng)臂末端的廣譜抗稻瘟病基因Pi-hk1進(jìn)行精細(xì)定位和候選基因預(yù)測(cè)，并利用關(guān)聯(lián)分析方法對(duì)秈稻地方品種的稻瘟病抗性

3、與SSR標(biāo)記進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。主要結(jié)果如下:
　　 1.稻瘟病抗性基因Pi-hk1的精細(xì)定位
　　 利用一個(gè)來(lái)自黑殼子粳和蘇御糯的重組自交系RIL72與輪回親本蘇御糯回交，構(gòu)建了包含目的基因Pi-hk1的BC1F3隱性純合感病個(gè)體組成的作圖群體，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，將Pi-hk1定位到水稻第11染色體長(zhǎng)臂RM27248與RM27318兩個(gè)標(biāo)記之間，Pi-hk1與這兩個(gè)標(biāo)記之間的遺傳距離分別為0.11和0.16c

4、M。進(jìn)一步在RM27248與RM27318之間篩選更多具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記，并開發(fā)ILP和InDel標(biāo)記，同時(shí)擴(kuò)大作圖群體，對(duì)目的基因進(jìn)行了精細(xì)定位。最終將抗病基因Pi-hk1定位于P3586和ILP3兩個(gè)標(biāo)記之間，遺傳距離約為0.031 cM的區(qū)域內(nèi)，與分子標(biāo)記P4098、RM7654和P4099共分離。利用Pi-hk1緊密連鎖的標(biāo)記P3586、RM7654和ILP3，通過(guò)PCR的方法在黑殼子粳BAC文庫(kù)中篩選陽(yáng)性克隆，共獲得3

5、個(gè)陽(yáng)性單克隆(No.66P14、No.242和No.91C13)。利用鳥槍測(cè)序法（上海美吉生物）對(duì)這三個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和拼接后，構(gòu)建了覆蓋目標(biāo)區(qū)段的BAC克隆重疊群。結(jié)果顯示，距Pi-hk1最近的兩個(gè)側(cè)冀標(biāo)記P3586與ILP3分別被錨定于No.66P14和No.91C13克隆上，兩者之間的物理距離約為107kb。
　　 2.稻瘟病抗性基因Pi-hk1的候選基因預(yù)測(cè)與分析
　　 利用三種生物信息軟件GEN

6、SCAN(http:∥genes.mit.edu)， FGENSH(http:∥linux1.softberry.com/)和RiceGAAS(http:∥rgp.dna.affrc.go.jp)對(duì)Pi-hk1基因所在區(qū)域進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)共存在16個(gè)可能的基因。生物信息學(xué)分析表明其中三個(gè)基因編碼功能未知蛋白（P3，P8和P9），一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座子蛋白（P14）。隨后對(duì)剩下的12個(gè)候選基因在黑殼子粳和蘇御糯中進(jìn)行了測(cè)序比

7、對(duì)，結(jié)果表明編碼富含半胱氨酸受體類蛋白激酶（P1），具有AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子（P5），核苷酸結(jié)合蛋白(P6)，β-糖苷酶（P10），兩個(gè)果膠裂解酶折疊蛋白（P11和P12）6個(gè)候選基因在親本序列沒(méi)有差異。而分別編碼BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白（P2），耐鎘因子(P4，MYB轉(zhuǎn)錄因子(P13)和三個(gè)NBS-LRR抗病結(jié)構(gòu)域蛋白(P7，P15和P16)的6個(gè)候選基因則在親本間序列存在差異。為了縮小候選基因范圍，本研究用real-timePCR

8、的方法檢測(cè)了16個(gè)候選基因在黑殼子粳中的表達(dá)模式。結(jié)果表明P1、P2、P11和P14在接種前和接種后均不表達(dá)，P4和P8在不同的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量基本相同，P3、P5、P6、P9、P10受稻瘟病菌輕微誘導(dǎo)，P7、P12、P13、P15和P16則強(qiáng)烈受稻瘟病菌誘導(dǎo)。基于以上分析，本研究將親本間序列存在差異且表達(dá)強(qiáng)烈受稻瘟病菌誘導(dǎo)的P7、 P13、P15和P16初步確定為Pi-hk1的候選基因。目前正在進(jìn)行4個(gè)候選基因的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證。
　　

9、 3.秈稻地方品種抗稻瘟病的關(guān)聯(lián)分析
　　 利用來(lái)自12條染色體的160個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)276份不同地域來(lái)源的秈稻地方品種進(jìn)行全基因組掃描，分析群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，以構(gòu)建關(guān)聯(lián)作圖群體。結(jié)果表明160個(gè)SSR位點(diǎn)在276份材料中共檢測(cè)到689個(gè)等位變異，平均每個(gè)標(biāo)記4.31個(gè)等位變異，變化范圍為2-8個(gè);基因多樣性指數(shù)平均值為0.49，變化范圍為0.08-0.76;全部SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)平均值為0.43，變

10、化范圍為0.08-0.72?；谀Ｐ偷娜后w結(jié)構(gòu)分析及基于遺傳距離的聚類分析都將全體材料劃分為7個(gè)亞群，表明這個(gè)群體具有廣泛的遺傳變異。
　　 基于全基因組掃描的關(guān)聯(lián)分析表明，在考慮群體結(jié)構(gòu)的情況下，與7個(gè)稻瘟病生理小種抗性顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.01)的標(biāo)記有26個(gè)，可解釋表型變異的范圍為2.68-13.11％，其中19個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)位于其它研究中定位到的QTL或基因所在區(qū)間。剩下的7個(gè)位點(diǎn)（RM10777、RM11051、RM161