大麥游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化及單倍體耐鹽、耐低氮脅迫篩選體系的建立.pdf

1、為了使大麥小孢子培養(yǎng)技術(shù)更具有實(shí)用性，以大田種植的大麥品種/品系為供試材料，研究了提取液中添加秋水仙堿、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)采用完整小花共培養(yǎng)以及優(yōu)化了誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的氮含量(有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮)，極大地提高了大麥游離小孢子培養(yǎng)的綠苗產(chǎn)量;為了確定大麥單倍體細(xì)胞水平與植株水平的耐鹽/低氮性之間是否一致，研究了鹽/低氮脅迫下大麥籽粒產(chǎn)量和萌發(fā)期生長(zhǎng)指標(biāo)(苗期植株生長(zhǎng)量)與小孢子培養(yǎng)階段的鹽/低氮脅迫下愈傷組織產(chǎn)量與對(duì)照之間的差異，單倍體細(xì)胞水平的耐鹽/低

2、氮性與植株水平的耐鹽/低氮性是一致的;在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展了小孢子水平誘變和鹽/低氮脅迫篩選研究，利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)快速獲得了耐鹽/低氮性優(yōu)于原始品種的、純合的變異體材料。主要研究結(jié)果如下:
　　 為了提高大田種植材料的小孢子培養(yǎng)效果，以大田生長(zhǎng)的、適合上海及周邊地區(qū)種植的優(yōu)良品種/品系為材料，研究了秋水仙堿對(duì)大麥離體小孢子活力以及胚狀體誘導(dǎo)率的影響。提取液和預(yù)處理液中添加10mg/L的秋水仙堿不僅可以提高小孢子提取時(shí)的存活率，還能

3、明顯降低小孢子在培養(yǎng)72h后的死亡率，但小孢子存活率提高的幅度和小孢子死亡率下降的幅度在供試材料之間相差很大，品系PDJ的預(yù)處理效果好于滬麥8號(hào)，對(duì)S22和花30的處理效果不明顯，由于PDJ在提取時(shí)的存活率最低，所以認(rèn)為在提取液和預(yù)處理液中添加秋水仙堿對(duì)小孢子活力低的材料更為必要。提取液和預(yù)處理液中添加秋水仙堿還能提高胚狀體的誘導(dǎo)率，促進(jìn)胚狀體的成苗潛力，綠苗分化率顯著提高。提取液和預(yù)處理液中的無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)供試材料小孢子培養(yǎng)的胚狀體產(chǎn)量

4、存在明顯的影響，但影響程度因基因型的不同而有所差異。
　　 為了研究小花共培養(yǎng)對(duì)大麥離體小孢子培養(yǎng)的影響，進(jìn)行了一下4個(gè)方面的研究。首先，以SD1、A11和E2為材料，小孢子培養(yǎng)時(shí)采用自生小花共培養(yǎng)，在培養(yǎng)7d時(shí)統(tǒng)計(jì)多細(xì)胞結(jié)構(gòu)(MCS)的數(shù)量，結(jié)果表明共培養(yǎng)處理的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯高于對(duì)照，相對(duì)值都達(dá)到1.5，表明添加小花可以促進(jìn)多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成。其次，研究了不同倍性小花共培養(yǎng)的效果，以S23和SD1為材料，共培養(yǎng)時(shí)分別采用自身

5、小花和93A小花共培養(yǎng)來(lái)比較不同共培養(yǎng)材料對(duì)小孢子培養(yǎng)多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胚狀體形成的影響，采用93A小花共培養(yǎng)時(shí)形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胚狀體的數(shù)量多于采用自身小花共培養(yǎng)的，由于93A是個(gè)四倍體材料，因而推測(cè)采用四倍體材料的共培養(yǎng)效果優(yōu)于采用二倍體的。第三，研究了小孢子培養(yǎng)材料低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)共培養(yǎng)效果的影響，以SD1為供試材料，離體穗經(jīng)15、20和25天低溫預(yù)處理后，收集小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)分別添加SD1和93A的小花進(jìn)行共培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和

6、胚狀體數(shù)量，小花共培養(yǎng)的效果在低溫預(yù)處理15天時(shí)最為明顯，隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而有所削弱，在低溫預(yù)處理達(dá)到25天時(shí)共培養(yǎng)的效果已不明顯。第四，進(jìn)一步比較了共培養(yǎng)材料小花的發(fā)育時(shí)期和低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)供試材料S23游離小孢子培養(yǎng)中胚狀體形成和綠苗率的影響，結(jié)果表明，不管小花取自單核或雙核期，也不管是否經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理，小花共培養(yǎng)的所有結(jié)果皆優(yōu)于對(duì)照;93A小花共培養(yǎng)的效果又優(yōu)于S23的，獲得了最高的胚狀體產(chǎn)量(每個(gè)培養(yǎng)皿的胚狀體數(shù)為862

7、.50±63.19)和最高的綠苗分化率(43.00％);用經(jīng)低溫處理15天的小花共培養(yǎng)得到了比未經(jīng)低溫處理的更多的胚狀體產(chǎn)量，但在綠苗頻率上表現(xiàn)并不一致;單核期小花共培養(yǎng)的胚狀體產(chǎn)量和綠苗率優(yōu)于雙核期的。從胚狀體產(chǎn)量上看，單核期小花的培養(yǎng)效果優(yōu)于雙核期的，小花低溫預(yù)處理后的效果也明顯優(yōu)于未經(jīng)低溫預(yù)處理的。從綠苗率上看，大致也是單核期小花的共培養(yǎng)效果比雙核期的好，但小花低溫預(yù)處理的效果不明顯，且略有下降。
　　 為了進(jìn)一步提高供試

8、材料的愈傷組織產(chǎn)量，優(yōu)化了誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的氮源，以KNO3和(NH4)2SO4作為無(wú)機(jī)氮，谷氨酰胺(Glu)和水解干酪素(CH)作為有機(jī)氮，比較了誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮濃度對(duì)一批大麥品種/品系小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量和綠苗分化的影響。結(jié)果表明降低誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮濃度、添加Glu和CH可以顯著地提高愈傷組織產(chǎn)量。培養(yǎng)基中KNO3和(NH4)2SO4單獨(dú)或共同存在時(shí)，所有供試材料的愈傷組織產(chǎn)量都很低;無(wú)論是KNO3還是(NH4)2SO4，

9、只要和有機(jī)氮同時(shí)存在，愈傷組織產(chǎn)量就會(huì)顯著提高;降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)氮濃度至原含量的1/2-1/4(KNO31415.0-707.5mg/L、(NH4)2SO4231.5-115.5mg/L)，8份供試材料中有6份的愈傷組織產(chǎn)量明顯提高;培養(yǎng)基中有機(jī)氮濃度(Glu和CH)從各800 mg/L提高至2000 mg/L，所有供試材料的愈傷組織產(chǎn)量隨著有機(jī)氮濃度的增加而提高;1/4N6的無(wú)機(jī)氮(KNO3707.5mg/L、(NH4)2SO4115

10、.5mg/L)結(jié)合2000mg/L有機(jī)氮(Glu和CH)的使用最適宜于愈傷組織的形成。研究還表明有機(jī)氮的濃度對(duì)綠苗分化率影響不大，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機(jī)氮濃度盡管對(duì)愈傷組織產(chǎn)量有著非常明顯的影響，但對(duì)愈傷組織分化成苗能力的影響較小，愈傷組織的再生能力在很大程度上取決于基因型。
　　 為了確定低氮脅迫下大麥籽粒產(chǎn)量和植株苗期生長(zhǎng)量與小孢子培養(yǎng)階段低氮脅迫下愈傷組織產(chǎn)量在供試品種內(nèi)變化趨勢(shì)是否一致，以4份(花-30、BR06-5、BI-4

11、5和BI-49)大麥品種/品系為供試材料，研究了培養(yǎng)基中有機(jī)氮使用量對(duì)小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)液中NH4NO3不同添加量對(duì)大麥苗期生長(zhǎng)量以及盆栽時(shí)正常施氮與不施氮處理對(duì)大麥單株產(chǎn)量的影響。培養(yǎng)基中有機(jī)氮含量的下降明顯降低小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量，當(dāng)培養(yǎng)基中有機(jī)氮濃度降至400mg/L時(shí)，所有供試材料愈傷組織產(chǎn)量極顯著下降，不同基因型間存在明顯的差異，4個(gè)供試材料愈傷產(chǎn)量的相對(duì)值明顯分成二類(lèi)，BI-49和BR06-5為一類(lèi)，相對(duì)值為0.

12、60和0.58;花-30和BI-45則為另一類(lèi)，相對(duì)值為0.44和0.40。營(yíng)養(yǎng)液中的氮素脅迫嚴(yán)重抑制供試材料苗期的生長(zhǎng)，降低植株高度、主根長(zhǎng)度和植株、根干重，不同基因型之間存在明顯的差異，BI-49和BR06-5的所有苗期統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的相對(duì)值都大于花-30和BI-45。盆栽時(shí)不施氮處理的大麥有效穗和單株產(chǎn)量低于正常施氮的對(duì)照，不同基因型間有差異，有效穗和單株產(chǎn)量的相對(duì)值都是BI-49＞BR06-5＞BI-45＞花-30。氮素脅迫下，4個(gè)供

13、試材料小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量的相對(duì)值與苗期植株高度、莖葉干重、主根長(zhǎng)度和根干重的相對(duì)值以及單株產(chǎn)量相對(duì)值的變化在品種內(nèi)具有相同的趨勢(shì)，證實(shí)了單倍體細(xì)胞水平與植株水平的耐低氮性之間的相關(guān)性。
　　 為了確定鹽脅迫下大麥籽粒產(chǎn)量和萌發(fā)期生長(zhǎng)指標(biāo)與小孢子培養(yǎng)階段的鹽脅迫下愈傷組織產(chǎn)量在供試品種內(nèi)變化趨勢(shì)是否一致性，以2份(花11和花30)大麥品種為供試材料，研究了誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NaCl含量對(duì)小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量的影響、萌發(fā)液中NaCl

14、含量對(duì)大麥種子萌發(fā)期生長(zhǎng)指標(biāo)的影響和NaCl脅迫處理對(duì)大麥單株產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NaCl含量提高可降低小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量，但2份品種的降幅存在明顯的差異，花30小孢子培養(yǎng)過(guò)程對(duì)NaCl相當(dāng)敏感，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NaCl含量達(dá)到0.1g/L時(shí)就嚴(yán)重影響愈傷組織的形成，愈傷組織產(chǎn)量從133.5mg/皿下降至78.0mg/皿;而花11的小孢子則對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中0.1～0.3g/L NaCl不敏感，愈傷組織產(chǎn)量在208.8mg/皿

15、-181.3mg/皿，沒(méi)有明顯下降。萌發(fā)液中NaCl含量提高可降低種子發(fā)芽率、主根長(zhǎng)度和胚芽鞘長(zhǎng)度，2份品種間降幅上也存在明顯的差異，花30的下降幅度大于花11。盆栽條件下NaCl脅迫處理的大麥單株產(chǎn)量明顯低于無(wú)NaCl的對(duì)照，2份品種間差異顯著，花11的單株籽粒產(chǎn)量從3.7g下降至2.9g，下降幅度為21.6％，花30的單株籽粒產(chǎn)量從4.4g下降至1.6g，下降幅度高達(dá)63.7％，花30的下降幅度明顯大于花11。NaCl脅迫下，2份供

16、試材料小孢子培養(yǎng)愈傷組織產(chǎn)量的相對(duì)值與萌發(fā)期的相對(duì)性狀以及成熟期單株產(chǎn)量的相對(duì)值變化趨勢(shì)品種內(nèi)是相同的，品種間是有差異的。
　　 進(jìn)行了利用大麥單倍體技術(shù)誘導(dǎo)篩選耐鹽變異體研究。以EMS、平陽(yáng)霉素和60Coγ-射線作為誘變劑，誘變花30的離體小孢子、離體穗和干種子，在小孢子培養(yǎng)的誘導(dǎo)和分化階段進(jìn)行NaCl的脅迫培養(yǎng)和篩選。結(jié)果表明，EMS誘變離體小孢子(1-5mg/L、48h)和60Coγ-射線輻照干種子(劑量率1GY/min、

17、劑量為400-500GY)誘變后小孢子培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于平陽(yáng)霉素誘變小孢子(1-5mg/L、48h)和60Coγ-射線輻照離體穗(劑量率1GY/min、劑量為5-15GY)。在誘變劑和誘變方法適宜的條件下(EMS誘變小孢子和60Coγ-射線輻照干種子)，脅迫篩選壓的確立對(duì)獲得再生植株的數(shù)量至關(guān)重要。EMS誘變后在300mg/L NaCl脅迫下愈傷產(chǎn)量為123.71mg/皿，這種愈傷組織在含3g/L NaCl的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗產(chǎn)量為35

18、.51株/100mg愈傷組織。花30干種子60Coγ-射線輻照后的植株的小孢子在300mg/L NaCl脅迫下愈傷產(chǎn)量為109.68mg/皿，愈傷組織在含3g/L NaCl的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗產(chǎn)量為17.14株/100mg。很明顯誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NaCl含量還可以提高些，但分化培養(yǎng)基中的3％ NaCl含量太高了，導(dǎo)致綠苗分化率下降太多，所以本試驗(yàn)獲得的耐鹽變異體數(shù)量太少。因而小孢子培養(yǎng)中 NaCl濃度和氮脅迫濃度仍需進(jìn)一步優(yōu)化。以16份源

19、于種子輻照處理的再生植株的自交一代種子為供試材料，比較了在0.5％ NaCl脅迫下種子的發(fā)芽率和幼苗的成活率以及植株的分蘗數(shù)、株高和單株產(chǎn)量，花30發(fā)芽率為0，供試的16份耐鹽變異體中，有14份材料NaCl脅迫下的發(fā)芽率優(yōu)于花30，鑒定出4份耐鹽性明顯優(yōu)于花30的變異體材料。選擇耐鹽變異體作為供試材料，測(cè)定了變異體中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1、NHX2和NHX3和甜菜堿醛脫氫酶基因BBD1和BBD2的表達(dá)模式和表達(dá)量，結(jié)果表明

20、變異體耐鹽性的提高與這些基因的表達(dá)量存在聯(lián)系。
　　 進(jìn)行了利用大麥單倍體技術(shù)誘導(dǎo)篩選耐低氮變異體研究。以大麥品種花30作為供試材料，比較了EMS和平陽(yáng)霉素處理小孢子，60Coγ-射線輻照處理離體穗和干種子，對(duì)游離小孢子在氮脅迫培養(yǎng)下誘導(dǎo)的愈傷組織產(chǎn)量和愈傷組織在氮脅迫下分化的綠苗數(shù)量的影響。花30的離體小孢子經(jīng)過(guò)EMS處理48h后在1/10無(wú)機(jī)氮、Glu和CH400mg/L的氮脅迫下愈傷產(chǎn)量為82.35mg/皿，這種愈傷組織在

21、含1/10無(wú)機(jī)氮的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗產(chǎn)量為126.76株/100mg愈傷?；?0的離體小孢子經(jīng)過(guò)平陽(yáng)霉素處理48h后在1/10無(wú)機(jī)氮、Glu和CH400mg/L的氮脅迫下愈傷產(chǎn)量只有36.75mg/皿，這種愈傷組織在含1/10無(wú)機(jī)氮的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗產(chǎn)量為10.49株/100mg愈傷?；?0離體穗經(jīng)過(guò)60Coγ-射線輻照后小孢子在1/10無(wú)機(jī)氮、Glu和CH400mg/L的氮脅迫下愈傷產(chǎn)量為37.65mg/皿，這種愈傷組織在含1/

22、10無(wú)機(jī)氮的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗產(chǎn)量為18.23株/100mg愈傷。花30干種子60Coγ-射線輻照后的植株的小孢子在1/10無(wú)機(jī)氮、Glu和CH400mg/L的氮脅迫下愈傷產(chǎn)量為67.08mg/皿，這種愈傷組織在含1/10無(wú)機(jī)氮的脅迫分化培養(yǎng)基上綠苗分化率為96.99株/100mg愈傷。EMS處理離體小孢子和60Coγ-射線輻照干種子的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗數(shù)量明顯優(yōu)于平陽(yáng)霉素處理小孢子和60Coγ-射線輻照離體穗。以140份源于EMS誘

23、變小孢子后培養(yǎng)獲得的再生植株自交一代種子為供試材料，播種后采用正常施肥和不施肥兩種處理，比較了變異體材料的分蘗數(shù)、成穗數(shù)、株高和單株產(chǎn)量。結(jié)果表明，大部分自交一代材料的分蘗數(shù)、有效穗和單株產(chǎn)量均高于原始品種花30。變異體自交一代中的產(chǎn)量性狀以及與產(chǎn)量性狀相關(guān)的一些性狀如分蘗數(shù)、脅迫下的株高優(yōu)于原始品種花30的變異體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于產(chǎn)量性狀劣于花30的變異體數(shù)量，即發(fā)生正向變異材料的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于負(fù)向變異材料的數(shù)量，表明小孢子水平的誘變和氮脅迫