牛、豬附紅細(xì)胞體病診斷方法的建立及粘附機(jī)制研究.pdf

1、附紅細(xì)胞體（Eperythrozoon）是一類附著于人和動(dòng)物紅細(xì)胞表面，或者游離于血漿中的不可培養(yǎng)的病原微生物。此類病原的感染會(huì)引起急性溶血性貧血從而對(duì)宿主致死，或者引起輕微的慢性貧血，宿主表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育不良，不孕和免疫抑制等，從而給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然至今已經(jīng)建立了一系列附紅細(xì)胞體的診斷技術(shù)，但是不同的診斷方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此需要建立更加敏感、高效、準(zhǔn)確的附紅細(xì)胞體檢測(cè)方法。另外，關(guān)于附紅細(xì)胞體與紅細(xì)胞之間的具體粘附機(jī)制研

2、究仍然是空白，因此對(duì)附紅細(xì)胞體粘附相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選以及功能研究對(duì)于闡述此種病原的致病機(jī)制就顯得尤為重要。
　　鑒于以上原因，本研究首先建立了溫氏附紅細(xì)胞體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，利用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的溫氏附紅細(xì)胞體的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，同時(shí)也對(duì)可能的傳播媒介中溫氏附紅細(xì)胞體的存在情況進(jìn)行了檢測(cè);隨后建立了基于豬附紅細(xì)胞體MSG1蛋白的間接ELISA方法，并進(jìn)行了初步的臨床應(yīng)用;之后從豬附紅細(xì)胞體的基因組信息中選擇

3、了五個(gè)可能的粘附相關(guān)蛋白，對(duì)這五個(gè)蛋白與豬紅細(xì)胞膜之間的粘附能力進(jìn)行了研究。
　　(1)溫氏附紅細(xì)胞體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank中溫氏附紅細(xì)胞體16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)溫氏附紅細(xì)胞體的PCR引物F3、B3，建立PCR檢測(cè)方法;同時(shí)設(shè)計(jì)一組特異性檢測(cè)溫氏附紅細(xì)胞體的LAMP引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，建立LAMP檢測(cè)方法。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP方法比P

4、CR方法的敏感度高出十倍。利用建立的兩種方法同時(shí)對(duì)來自全國(guó)部分地區(qū)共330份牛血液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，LAMP方法檢測(cè)出了71份陽性樣品，而PCR方法僅檢測(cè)出了62份陽性樣品，且所有PCR方法檢測(cè)陽性的樣品均為L(zhǎng)AMP檢測(cè)陽性。通過測(cè)序?qū)?份PCR檢測(cè)陰性但LAMP檢測(cè)陽性的樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)此9份樣品均為溫氏附紅細(xì)胞體感染。此外，利用兩種檢測(cè)方法同時(shí)對(duì)牛棚中采集的17只蜱、24只虱子、25只蚊子、22只蠅進(jìn)行了溫氏附紅細(xì)胞體的檢測(cè)，

5、結(jié)果顯示PCR和LAMP方法均在7只蜱、13只虱子、16只蚊子、以及22只蠅中檢測(cè)到了溫氏附紅細(xì)胞體的存在。此結(jié)果提示此類節(jié)肢動(dòng)物作為附紅細(xì)胞體傳播媒介的可能性。
　　(2)基于溫氏附紅細(xì)胞體16SrRNA基因進(jìn)化樹的構(gòu)建
　　通過將部分溫氏附紅細(xì)胞體陽性樣品的16SrRNA基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆測(cè)序，得到8條來自于河南(HN)、江蘇(JS)、湖北(HB)、四川(SC)、安徽（AH）等地的溫氏附紅細(xì)胞體16SrRNA基因序列。

6、將此八條序列與Genbank中所下載的其他血營(yíng)養(yǎng)型支原體相關(guān)序列用MEGA軟件采用鄰接法建立進(jìn)化樹。通過進(jìn)化樹可以看出，所獲得的八條序列均位于溫氏附紅細(xì)胞體的分支上，不同的地理分離株之間沒有明顯的差異，而相對(duì)于豬附紅細(xì)胞體來說，溫氏附紅細(xì)胞體與羊附紅細(xì)胞體的親緣關(guān)系更為接近，所有的血營(yíng)養(yǎng)型支原體構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立的分支，并且與肺炎支原體比較接近。
　　(3)豬附紅細(xì)胞體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用
　　根據(jù)Genban

7、k中豬附紅細(xì)胞體(MycoplasmasuisMSG1基因序列(GenBankID:AM407404.1)為靶基因設(shè)計(jì)了一對(duì)可以擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體MSG1基因主要抗原決定部位的PCR引物，經(jīng)過克隆測(cè)序后，將此段基因插入原核表達(dá)載體pET28a，之后進(jìn)行MSG1蛋白的原核表達(dá)。通過對(duì)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定MSG1重組蛋白原核表達(dá)的最佳條件，在此條件下進(jìn)行MSG1蛋白的大量提取。利用提取的MSG1重組蛋白建立了檢測(cè)豬附

8、紅細(xì)胞體的間接ELISA方法，且此方法具有良好的特異性及重復(fù)性。將建立的間接ELISA方法進(jìn)行了初步的臨床應(yīng)用，初步檢測(cè)結(jié)果顯示成年豬中豬附紅細(xì)胞體感染的抗體陽性率明顯高于小豬。
　　(4)豬附紅細(xì)胞體粘附蛋白的篩選
　　從Genbank中公布的豬附紅細(xì)胞體基因組文庫中選擇了五個(gè)假定粘附蛋白，分別用粘附ELISA試驗(yàn)以及血涂片粘附試驗(yàn)對(duì)這五個(gè)蛋白的粘附效果進(jìn)行了比較。為了讓這五個(gè)蛋白能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中順利表達(dá)，先進(jìn)行了

9、堿基點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)優(yōu)化其密碼子;之后利用表達(dá)的重組蛋白制備多克隆抗體血清，隨后進(jìn)行了多抗血清IgG的純化以及生物素標(biāo)記;粘附ELISA結(jié)果顯示，GAPDH蛋白具有最強(qiáng)的粘附于豬紅細(xì)胞膜的能力，其次為OSGEP蛋白;粘附抑制試驗(yàn)說明此兩種蛋白的多抗血清能夠特異性的阻斷其粘附作用;五個(gè)蛋白的大腸桿菌亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，此五個(gè)重組蛋白分別在大腸桿菌的菌膜和菌質(zhì)中均有表達(dá);血涂片粘附試驗(yàn)結(jié)果與粘附ELISA結(jié)果吻合，表達(dá)GAPDH蛋白以及OSGEP