核盤(pán)菌弱毒相關(guān)DNA病毒1特性及其應(yīng)用潛能研究.pdf

1、核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary)是一種分布廣泛的重要植物病原真菌。由其引起的菌核病是多種農(nóng)作物的重要病害，嚴(yán)重威脅農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。真菌病毒廣泛存在于真菌中，一些真菌病毒可以引起病原真菌致病力衰退，對(duì)作物真菌病害具有良好的生物防治潛力。
　　 從來(lái)自油菜罹病植株的菌核中分離獲得了核盤(pán)菌菌株DT-8。DT-8表現(xiàn)出弱毒特性，其菌絲生長(zhǎng)緩慢、菌絲細(xì)且分支雜亂、色素分布不均、菌核

2、小且菌核原基形成時(shí)間晚于健康菌株4～6天，致病力非常弱。在DT-8的菌絲中分離獲得了兩條小的ssDNA片段，大小分別為2kb和500 bp左右。挑取DT-8的菌絲尖端進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得不攜帶這兩條DNA片段的培養(yǎng)物，它們?cè)谏L(zhǎng)、菌核形成和致病力等方面與正常菌株沒(méi)有顯著區(qū)別，但通過(guò)與DT-8接觸后，它們可以重新獲得2 kb和500 bp的DNA片段，并表現(xiàn)出弱毒特性，推定這兩條的DNA片段與DT-8菌株的弱毒現(xiàn)象相關(guān)。經(jīng)克隆和測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)

3、2.0 kb DNA片段為單鏈環(huán)狀DNA病毒，500 bpDNA為其亞基因組，命名該病毒為核盤(pán)菌弱毒相關(guān)DNA病毒1(Sclerotiniasclerotiorum hypovirulence associated DNA virus1,SsHADV-1)。
　　 病毒SsHADV-1的基因組全長(zhǎng)2166 nt，編碼兩個(gè)基因，病毒鏈編碼外殼蛋白(coat protein，CP)，互補(bǔ)鏈編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Replication a

4、ssociated protein，Rep);兩個(gè)開(kāi)放閱讀框由大基因間隔區(qū)(Large intergenic region，LIR)和小基因間隔區(qū)(Small intergenic region，SIR)隔開(kāi)，在LIR中包含復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始的相關(guān)元件，這些結(jié)構(gòu)都與雙生病毒科中玉米線條病毒屬的病毒基因組結(jié)構(gòu)相似。對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)Rep的氨基酸序列與雙生病毒同源性較高可以聚為一簇，Rep中包含有類(lèi)似雙生病毒的保守結(jié)構(gòu)域和滾環(huán)復(fù)制相

5、關(guān)的模體;而CP在已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到任何同源序列。透射電鏡觀察SsHADV-1病毒粒子形態(tài)，呈等軸球形，直徑20～22 nm。該發(fā)現(xiàn)首次證實(shí)了真菌中存在DNA病毒，也為雙生病毒的起源和進(jìn)化研究提供了新的材料。
　　 一般認(rèn)為真菌病毒缺乏體外傳播途徑，只能通過(guò)寄主的菌絲融合和繁殖進(jìn)行傳播，真菌病毒的這種特性也是限制利用病毒控制真菌病害的重要因子。對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明SsHADV-1可以在核盤(pán)菌不同營(yíng)養(yǎng)親和型之間較高頻率地?cái)U(kuò)散，

6、預(yù)示SsHADV-1在自然界的擴(kuò)散可能不會(huì)受到寄主營(yíng)養(yǎng)體不親和性的限制。當(dāng)純化的病毒粒子與核盤(pán)菌菌落接觸后，可以直接侵入核盤(pán)菌菌絲，使其轉(zhuǎn)變成弱毒菌株;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)病毒粒子可以直接侵染所有測(cè)試的不同營(yíng)養(yǎng)體親和型的核盤(pán)菌菌株，表明SsHADV-1對(duì)寄主的營(yíng)養(yǎng)親和型沒(méi)有選擇性。病毒DNA沒(méi)有侵染性，不能直接侵染菌絲，甚至也不能侵染核盤(pán)菌的原生質(zhì)體，表明S sHADV-1的直接侵染需要有完整的病毒粒子;但研究也發(fā)現(xiàn)病毒DNA可以在聚乙二醇(

7、PEG)的介導(dǎo)下成功轉(zhuǎn)染核盤(pán)菌原生質(zhì)體。這些試驗(yàn)結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了S sHADV-1可以引起核盤(pán)菌的致病力衰退，也首次表明有些真菌病毒，如SsHADV-1，存在體外傳播途徑。
　　 SsHADV-1存在體外傳播途徑，預(yù)示該病毒對(duì)菌核病具有良好的生防潛力。用2mg/ml SsHADV-1病毒粒予預(yù)處理離體或活體擬南芥，可以有效抑制核盤(pán)菌的侵染和菌核病發(fā)病，在所形成的病斑上可以分離到攜帶S sHADV-1的菌株，表明在擬南芥葉片上

8、的SsHADV-1病毒粒子對(duì)核盤(pán)菌有侵染能力。再者，菌核病病斑形成2天后噴灑SsHADV-1病毒粗提液，可以抑制煙草和油菜葉片上的病斑擴(kuò)展，保護(hù)植株免遭核盤(pán)菌殺死，表明直接利用病毒粒子具有防治菌核病的潛能。大田試驗(yàn)也取得了顯著的防病效果，噴灑攜帶SsHADV-1的核盤(pán)菌菌絲片段（～1×105 cfu/mL）使菌核病發(fā)病率降低33.56％，促進(jìn)油菜產(chǎn)量提高16.44％。將病毒粒子涂抹在活體擬南芥葉片表面，在15天后仍能檢測(cè)到病毒存在，表明

9、病毒粒子在體外相對(duì)穩(wěn)定。研究表明SsHADV-1的寄主范圍非常窄，只能侵染核盤(pán)菌屬內(nèi)真菌，不能夠侵染與核盤(pán)菌親緣關(guān)系相近的灰葡萄孢;熒光原位雜交試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增試驗(yàn)均表明SsHADV-1不能在擬南芥細(xì)胞中復(fù)制和增殖。這些試驗(yàn)結(jié)果表明可以利用SsHADV-1控制油菜菌核病。
　　 為深入研究病毒和寄主的相互關(guān)系，本研究成功建立了包含部分重復(fù)序列的SsHADV-1病毒全長(zhǎng)的侵染性克隆載體。分別將2.0、1.8、1.3或1個(gè)單位長(zhǎng)度的

10、病毒基因組序列正向重復(fù)連入載體pKS中，利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)染核盤(pán)菌原生質(zhì)體的方式實(shí)現(xiàn)侵染。含有兩個(gè)病毒LIR的的侵染性克隆載體轉(zhuǎn)染后能夠得到表型異常的再生菌株，經(jīng)過(guò)核酸提取、特異性引物擴(kuò)增和對(duì)峙培養(yǎng)傳毒試驗(yàn)分析，證明轉(zhuǎn)染子中存在游離的可水平傳播的SsHADV-1病毒全長(zhǎng);然而含有1個(gè)單位長(zhǎng)度的病毒基因組的載體轉(zhuǎn)染后不能獲得帶毒的轉(zhuǎn)染子。統(tǒng)計(jì)含有兩個(gè)LIR結(jié)構(gòu)的不同重復(fù)長(zhǎng)度的載體轉(zhuǎn)染成功率，發(fā)現(xiàn)重復(fù)片段越長(zhǎng)，獲得帶毒轉(zhuǎn)染子的頻率越高，因此推

11、測(cè)在SsHADV-1侵染性克隆載體釋放游離病毒時(shí)，病毒重復(fù)序列之間的同源重組可能是產(chǎn)生病毒主要的途徑。
　　 構(gòu)建了缺失CP基因的SsHADV-1侵染性克隆載體，發(fā)現(xiàn)不含CP的缺陷病毒可以在核盤(pán)菌原生質(zhì)體內(nèi)復(fù)制，但是病毒核酸積累量很低而且不能系統(tǒng)侵染，在再生菌株中檢測(cè)不到穩(wěn)定存在的病毒;用綠色熒光蛋白基因eGFP替換CP基因，轉(zhuǎn)染后可以在再生菌株的部分菌絲內(nèi)觀察到綠色熒光，但隨再生菌株的生長(zhǎng)，不能再檢測(cè)到綠色熒光，說(shuō)明缺乏CP的