羊口瘡病毒感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化及功能分析.pdf

1、羊傳染性膿皰(contagiousecthyma)俗稱“羊口瘡”，是由痘病毒科，副痘病毒屬羊口瘡病毒（orfvirus，ORFV）引起的一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病。該病主要侵害綿羊和山羊。臨床上患病動物以口唇周圍和乳房部位皮膚形成丘疹、水皰、膿皰和疣狀痂皮為特征。該病發(fā)病率高，病死率低。羊傳染性膿皰的暴發(fā)和流行不但嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人們的身體健康。
　　隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，多株羊口瘡病毒的全基因組序

2、列被測定，這為羊口瘡病毒致病的分子機(jī)制研究提供了參考，但是基因組學(xué)技術(shù)研究只針對病原體自身，而不能反映病原體與宿主間的相互作用。目前利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對ORFV和宿主細(xì)胞相互作用的研究未見相關(guān)報道。本研究以O(shè)RFV和山羊皮膚成纖維細(xì)胞(goat skin fibroblasts，GSFs)為研究對象，應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(two-dimensionalliquidchromatography-tand

3、emmassspectrometrycoupledwithisobarictagsforrelativeandabsolutequantification,iTRAQ-2D-LC-MS/MS)對ORFV感染GSFs后的蛋白組學(xué)變化，進(jìn)行了探索研究和功能分析，期望能為人們了解羊口瘡病毒與宿主細(xì)胞的相互作用研究提供參考信息，具體研究內(nèi)容如下:
　　1.羊口瘡病毒囊膜蛋白(B2L)單克隆抗體(MonoclonaiAntibodies，M

4、cAb)的制備
　　參照GenBank上公布的ORFVB2L基因序列(GU320351)設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用PCR方法獲得ORFVB2L基因全長，并將其定向連接到原核表達(dá)載體pET-30a上，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化。以純化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，并利用雜交瘤技術(shù)將免疫脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過4次篩選和克隆，獲得4株穩(wěn)定分泌抗ORFVB2L蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為D1-B3，E4-C6，3-A1

5、1-2，B1-F3-A3。單抗亞類鑒定結(jié)果表明4株單抗的亞類均為IgG1，Western-blot和間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明4株單抗均能與羊口瘡病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　2.羊口瘡病毒在GSFs上的適應(yīng)性和增殖特性研究
　　將從患病羊痂皮病料中分離出的ORFV在GSFs上進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)，以探討病毒在該細(xì)胞上的增殖特性。對GSFs首次接種ORFV后進(jìn)行細(xì)胞病變觀察和間接免疫熒光檢測(indirectimmunofluoresc

6、entassay，IFA)。結(jié)果顯示ORFV首次感染GSFs24h后開始有少量細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和變圓，60h細(xì)胞開始脫落，72h病變完全。IFA結(jié)果顯示接種ORFV的GSFs有特異性綠色熒光，表明ORFV能在GSFs內(nèi)復(fù)制增殖。收集ORFV首次感染GSFs后不同時間點(diǎn)的病毒液進(jìn)行病毒基因組拷貝數(shù)的Real-timePCR檢測和TCID50測定，Real-timePCR檢測結(jié)果顯示感染后9h即可檢測到病毒DNA，隨感染時間延長病毒基因組拷貝數(shù)

7、快速上升，72h達(dá)到最大(5.52×106copy/uL)。TCID50測定結(jié)果與病毒基因組拷貝數(shù)的增長趨勢基本一致。
　　在此基礎(chǔ)上，將ORFV在GSFs上連續(xù)傳至15代使其適應(yīng)該細(xì)胞。結(jié)果顯示隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞開始出現(xiàn)病變時間逐漸縮短，至10代后病變穩(wěn)定。以第15代GSFs適應(yīng)毒(CHINALuoyang2013)感染GSFs，感染后不同時間分別收集感染細(xì)胞和培養(yǎng)上清，利用Real-timePCR對不同樣品的病毒DNA進(jìn)

8、行定量分析，繪制ORFV在GSFs上的一步法生長曲線。結(jié)果顯示:感染后3h～35h，細(xì)胞內(nèi)病毒DNA含量隨感染時間延長而增加，之后因細(xì)胞裂解病毒DNA含量逐漸降低;細(xì)胞外病毒DNA含量呈“S型”曲線增長，感染后0h～11h為潛伏期，病毒含量維持在較低水平，第11h～43h為突破期，病毒DNA含量迅速增加，感染后43h～51h增長速度減慢，逐步進(jìn)入穩(wěn)定期。
　　3.羊口瘡病毒的遺傳進(jìn)化分析和ORF125蛋白的亞細(xì)胞定位
　　利

9、用DNAstar和MEGA4.0對ORFVGSFs適應(yīng)毒株CHINALuoyang2013進(jìn)行基于B2L基因的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明CHINALuoyang2013與2012中國疫苗株(JQ904789)同源性最高，處于同一進(jìn)化分支。
　　利用DNAstar和在線ExPASy工具對ORFVORF125蛋白與Bcl-2蛋白家族成員的氨基酸序列和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF125與Bcl-2家族蛋白一級結(jié)構(gòu)同源性很低，但兩者二

10、級結(jié)構(gòu)中α-螺旋位置和數(shù)量相似，推測它們也有著相似的三級結(jié)構(gòu)，可能具備相同的功能。參考ORFVNZ2的ORF125基因序列(DQ184476)設(shè)計(jì)引物，利用常規(guī)分子克隆方法構(gòu)建綠色熒光重組表達(dá)載體pEGFP-ORF125，瞬時轉(zhuǎn)染GSFs后觀察ORF125在GSFs中的定位情況，結(jié)果顯示ORFV125蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)，在細(xì)胞核中僅有少量分布。
　　4.羊口瘡病毒感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組變化及功能分析
　　以GSFs首次接種

11、ORFV為感染模型，利用iTRAQ-2D-LC-MS/MS技術(shù)研究病毒感染細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)變化。分別提取病毒感染53h后感染細(xì)胞和正常細(xì)胞的總蛋白，依次經(jīng)烷基化，還原，酶解處理，iTRAQ標(biāo)記和混合等過程，最后經(jīng)液相色譜分離后再經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。質(zhì)譜分析結(jié)果表明共鑒定到2776個蛋白，有282個蛋白發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)蛋白222個，下調(diào)表達(dá)蛋白60個。
　　利用基因本體(GeneOntology，GO)數(shù)據(jù)庫對這些

12、差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白幾乎均勻處于細(xì)胞的所有組分中，主要參與細(xì)胞形態(tài)發(fā)生，蛋白合成，新陳代謝，免疫監(jiān)視，外界刺激反應(yīng)等過程;差異表達(dá)蛋白的分子功能包括結(jié)合、催化、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)構(gòu)分子和酶調(diào)節(jié)等活性。蛋白相鄰類的聚簇(ClusterofOrthologousGroups，COG)注釋分類結(jié)果表明這些差異表達(dá)蛋白主要涉及翻譯后修飾，蛋白折疊，分子伴侶，核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成，能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。利用KE

13、GG數(shù)據(jù)庫對這些差異蛋白進(jìn)行Pathway顯著性富集分析，結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白主要參與蛋白酶體，剪接體，糖酵解和糖新生途徑，磷酸戊糖途徑，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activativedreceptors，PPAR)信號通路，NF-kappaB信號通路，雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信號通路，β-TGF信號通路，內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣吸收

14、途徑，抗原呈遞途徑，天然殺傷性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用途徑，細(xì)胞內(nèi)吞途徑等。
　　5.HSPA1B蛋白的亞細(xì)胞定位及其對ORFV增殖的影響
　　選取差異表達(dá)蛋白HSPA1B構(gòu)建綠色熒光重組表達(dá)載體pEGFP-HSPA1B，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察HSPA1B在GSFs中的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示HSPA1B蛋白彌散地分布在胞質(zhì)中。在GSFs上過表達(dá)HSPA1B，然后用ORFV感染該細(xì)胞，并利用Real-timePCR檢測病毒的增殖，分析