桑樹中一種新病毒和一種小分子環(huán)狀RNA的研究.pdf

1、近年，我們從?；ㄈ~卷葉病葉組織中發(fā)現(xiàn)一種新的球狀病毒和一種新的小分子環(huán)狀RNA，為了闡明該病毒及小分子環(huán)狀RNA的生物學(xué)和分子生物學(xué)特征以及與該病發(fā)生的關(guān)系，本研究將：1.利用錨定隨機(jī)引物及5',3'-RACE對新發(fā)現(xiàn)病毒的基因組序列進(jìn)行克隆，分析基因組的分子特征，確立分離出的病毒的分類地位；建立病毒抗血清新的制備方法并建立病毒的血清學(xué)檢測方法；利用RT-PCR對病毒進(jìn)行檢測并根據(jù)檢測結(jié)果提出病毒與桑花葉卷葉病發(fā)生的關(guān)系；2.繼續(xù)對先前

2、分離出的小分子環(huán)狀 RNA（Mulberry small circular RNA, mscRNA）進(jìn)行研究，克隆mscRNA的全長序列，分析其分子結(jié)構(gòu)特征；通過回接mscRNA以及構(gòu)建的mscRNA侵染性克隆，確定mscRNA是否具有侵染性，揭示mscRNA與桑花葉卷葉病的關(guān)系；建立靈敏、快速、可靠的分子檢測方法對不同地區(qū)的病桑進(jìn)行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果提出mscRNA與?；ㄈ~卷葉病發(fā)生以及癥狀表現(xiàn)的關(guān)系。結(jié)果如下：
　　1.通過

3、電子顯微鏡觀察，桑花葉卷葉病葉中的球狀病毒粒體直徑為28-30 nm。其基因組由2條正單鏈RNA（ssRNA）組成，RNA1和RNA2的全長分別為7183 nt和3742 nt[都不包括poly（A）尾的長度]，2條RNA鏈都只包含一個開放閱讀框，RNA1的開放閱讀框編碼一個由2102 aa組成，相應(yīng)分子量約為235.1 kDa的多聚蛋白P1，RNA2的開放閱讀框編碼一個由1093 aa組成，相應(yīng)分子量約為120.5 kDa的多聚蛋白P

4、2；基于P1的氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹表明，該病毒屬于線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)病毒；P1的氨基酸序列包含Hel、VPg、RdRp保守性氨基酸基序以及半胱氨酸蛋白酶（Pro）的催化三聯(lián)體；該病毒外殼蛋白位于P2的 C端，運(yùn)動蛋白位于P2的 N端，通過NetPicoRNA1.0 Server軟件預(yù)測以及Western blot分析，推測運(yùn)動蛋白與外殼蛋白之間的切割位點(diǎn)位于553E/V554，這個切割位點(diǎn)以前未曾報(bào)道過，是3CL

5、（pro）一個新的切割位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生一個分子量約為59 kDa的外殼蛋白?；谕鈿さ鞍装被嵝蛄袠?gòu)建的進(jìn)化樹分析、RNA2的核苷酸序列長度、RNA1和RNA2的3'-UTR和5'-UTR的核苷酸序列特征以及國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次報(bào)告提出的Nepovirus新病毒認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)（與其它Nepovirus病毒比較，外殼蛋白的氨基酸序列的相

6、似性<75％），該病毒屬于Nepovirus屬A亞組的一種新病毒。由于該病毒最初是從桑花葉卷葉病的葉組織中分離出來的，其與?；ㄈ~卷葉病的關(guān)系還沒有通過 Koch’s法則確定，我們暫時將該病毒命名為?；ㄈ~卷葉病相關(guān)病毒（Mulberry Mosaic Leaf Roll-associated Virus, MMLRaV）。
　　RT-PCR的檢測結(jié)果顯示，從浙江省湖州市、江蘇省海安縣和江蘇省鎮(zhèn)江市的桑園中采集到的61份表現(xiàn)

7、桑花葉卷葉病癥狀樣品中，58份樣品檢測出含有MMLRaV，病毒的侵染率高達(dá)95%，這個結(jié)果說明，MMLRaV在浙江和江蘇的桑園中普遍存在，絕大多數(shù)表現(xiàn)?；ㄈ~卷葉病癥狀的桑樹均受到MMLRaV的侵染，MMLRaV與?；ㄈ~卷葉病的發(fā)生有著明顯的關(guān)聯(lián)。
　　2. mscRNA浙江分離株mscRNA-zj是由356 nt核苷酸組成，G+C含量為51.12%，經(jīng)過BLAST比對，mscRNA-zj序列與已報(bào)道的Mulberry small

8、circular viroid-like RNA1 isolate201110151（JQ809700）和Mulberry small circular viroid-like RNA1（EU547491）的序列的相似性高達(dá)99%，然而，我們通過實(shí)驗(yàn)獲得的 mscRNA-zj序列與已報(bào)道這2個分離株的極性相反。通過mfold預(yù)測mscRNA的最穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)呈支鏈狀，在37℃下，這種結(jié)構(gòu)的最低自由能是-601.6 kJ/mol，鏈內(nèi)65

9、.7%的堿基能夠配對，比以前報(bào)道的浙江株和陜西株2個分離株的最低自由能更低，鏈內(nèi)堿基配對比例更高，mscRNA-zj支鏈狀二級結(jié)構(gòu)與鱷梨日斑類病毒科（Avsunviroidae）類病毒和一些病毒的環(huán)狀單鏈衛(wèi)星RNA的支鏈狀二級結(jié)構(gòu)相似。mscRNA-zj的正鏈上含有錘頭型核酶，根據(jù)錘頭型核酶的自我切割特性推測了mscRNA-zj復(fù)制過程中自我切割位點(diǎn)的位置。不同地理分布的mscRNA存在序列多樣性。LiCl法提取的mscRNA以及構(gòu)建的

10、侵染性克隆的接種結(jié)果顯示，mscRNA-zj單獨(dú)存在是不能在其自然寄主-桑樹體內(nèi)自我復(fù)制，也不能在鑒別寄主-番茄中自我復(fù)制，初步認(rèn)為mscRNA是一種桑樹病毒的衛(wèi)星RNA而不是一種新的類病毒。通過建立的單管一步 RT-PCR對田間發(fā)生的?；ㄈ~卷葉病的檢測，結(jié)果顯示，mscRNA不僅與?；ㄈ~卷葉病的癥狀表現(xiàn)沒有明顯的關(guān)系，而且與該病的發(fā)生沒有明顯的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：MMLRaV是一種新的線蟲傳多面體病毒，歸屬于該屬的A亞組，與桑花葉