旋毛蟲分子分類和49ku結(jié)構(gòu)基因在昆蟲細胞中表達研究.pdf

1、18S rRNA基因是一類編碼核糖體小亞基RNA、長約1800bp的DNA序列,由于在生物體內(nèi)含量較大占80﹪左右,且在進化過程中非常保守,核苷酸的替換率較低,因而它是探討生物高級分類群系統(tǒng)演化的難得工具之一.該實驗克隆并比較了旋毛蟲5個隔離種的18S rRNA基因序列,分析他們的同源性,為旋毛蟲的分類和診斷開辟了新的途徑.旋毛蟲排泄分泌(Excretory-Secretory antigen,ES)抗原,即旋毛蟲生長過程中的排泄分泌產(chǎn)

2、物,是旋毛蟲檢測和免疫的良好抗原.該實驗將本地毛形線蟲(Trichinella nativa)ES抗原的49ku結(jié)構(gòu)基因構(gòu)建到桿狀病毒表達載體上,并在昆蟲細胞中得到表達.該實驗以NCBI中U60231序列為參考,設(shè)計并合成引物,用改進的AGPC方法結(jié)合Trizol LS試劑盒提取旋毛蟲總RNA,用分光光度計檢測RNA的質(zhì)量.然后用特異性引物,對旋毛蟲標準隔離種旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)和本地毛形線蟲(Tric

3、hinella nativa),以及分離自黑龍江省的豬旋毛蟲、犬旋毛蟲和貓旋毛蟲5個旋毛蟲隔離種進行RT-PCR擴增目的基因18S rRNA片段,均擴增出1800bp左右的基因片段.將目的基因與克隆載體pMD18-T連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中,篩選陽性重組子,并將陽性質(zhì)粒送有關(guān)生物公司測序,同時在哈爾濱獸醫(yī)研究所生物技術(shù)重點實驗室也進行測序.用DNAstar和Genedoc軟件分析結(jié)果顯示,18S rRNA基因的種間同源性很高,均在

4、99﹪以上.豬旋毛蟲與旋毛形線蟲的同源性為99.4﹪,犬旋毛蟲與本地毛形線蟲的同源性為99.3﹪,貓旋毛蟲與旋毛形線蟲比與本地毛形線蟲的同源性要略高0.4﹪.因此,豬旋毛蟲與旋毛形線蟲,犬旋毛蟲與本地毛形線蟲的親緣關(guān)系更近,這與傳統(tǒng)分類學的結(jié)果相符合.本地毛形線蟲和豬旋毛蟲的18S rRNA基因序列已經(jīng)提交NCBI,序列號分別為AY487254和AY497012.這為旋毛蟲分類學的研究開創(chuàng)了一種新的方法和思路.根據(jù)BAC-TO-BAC桿

5、狀病毒表達系統(tǒng)的供體質(zhì)粒,設(shè)計表達引物,從克隆質(zhì)粒上擴增本地毛形線蟲49ku ES結(jié)構(gòu)基因,酶切后與供體質(zhì)粒連接,在大腸桿菌中克隆,將克隆有外源基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞,該細胞含有桿狀病毒穿梭載體,供體質(zhì)粒中的外源基因在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下,通過轉(zhuǎn)座而插入桿狀病毒基因組中,篩選含有重組質(zhì)粒的Bacmid DNA,用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染昆蟲細胞獲得重組病毒.SDS-PAGE電泳顯示表達蛋白為36ku的融合蛋白,將表達產(chǎn)