極端草甘膦環(huán)境中EPSP合酶基因的克隆及其抗性相關(guān)位點的鑒定.pdf

1、該論文以5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosp-hate Syntheses簡稱EPSP合酶)為研究對象,以克隆新的EPSP合酶和鑒定EPSP合酶基因中草甘膦抗性相關(guān)位點為目的來進行研究,以獲得擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗性基因.采用免培養(yǎng)技術(shù)提取極端草甘膦污染土壤的總DNA,利用Sau3AI酶進行部分消化并與載體連接轉(zhuǎn)入EPSP合酶缺陷型大腸桿菌ER2799感受態(tài)細胞中而構(gòu)建形成土壤

2、總DNA的基因文庫.通過EPSP合酶互補實驗獲得了一株草甘膦耐受菌株ERAM1,檢測其耐受草甘膦濃度高達150mM,將該菌株重組質(zhì)粒的外源插入片段進行測序,結(jié)果顯示該插入的外源片段總長度為3.6kb,其中含有一個454個氨基酸序列的閱讀框架,該基因與美國草甘膦抗性相關(guān)的美國專利(專利號6,225,114)涉及Escherichia coli,Salmonella typhimueium,Arabidopsis thaliana,Aero

3、monas salmonicida,Brassica napus,Aspergillus nidulans的aroA基因核苷酸序列和氨基酸序列幾乎沒有同源性,與美國專利(專利號6,248,876)所提到Achromobacter sp.LBAA,Agrobacterium sp.CP4,Pseudomonas sp.PG2982,Staphylococcus aureus的aroA基因氨基酸同源性在45％以下,但與Bacillus su

4、btilis的aroA基因氨基酸同源性比較接近(56%).表明我們所克隆的基因是一個結(jié)構(gòu)比較新穎的EPSP合酶基因,并且具有較高的草甘膦抗性.利用來源于已有的高抗草甘膦菌株(草甘膦濃度高達500mM)炭光假單胞菌G2的EPSP合酶基因序列設(shè)計引物,直接對未經(jīng)草甘膦污染的土壤稀釋培養(yǎng)的單菌落進行PCR來研究細菌抗草甘膦機理.通過分析PCR擴增結(jié)果獲得一株能夠擴增出1.35kb片段的菌株即L35菌株,草甘膦抗性分析發(fā)現(xiàn)該菌株在草甘膦濃度高于

5、350mM時不能生長而G2菌株在該草甘膦濃度下能很好生長,說明L35菌株草甘膦抗性明顯低于G2菌株的草甘膦抗性.L35菌株的16s rRNA基因分類結(jié)果顯示L35和G2為同一屬,均為假單胞菌.EPSP合酶基因測序結(jié)果顯示L35與G2的EPSP合酶基因只有兩個堿基的差異,氨基酸也相應(yīng)地發(fā)生了兩個堿基的變化即Ser-83和Asp-94,此變化的氨基酸位點不在美國保護專利范圍內(nèi).對L35進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及高級結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn),發(fā)生變化的氨基酸位點

6、恰好位于酶與底物結(jié)合部位,但不屬于關(guān)鍵部位.證明了的確存在一些菌株其本身就有草甘膦抗性特性,在環(huán)境誘導(dǎo)下,EPSP合酶基因發(fā)生突變使草甘膦抗性增高.,將ERL1 35、G2和ERAM1三種菌株的EPSP合酶基因的堿基序列和氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn),三者的堿基序列的同源率為57.46%,而氨基酸的同源率為42.24%,說明三者EPSP合酶基因具有明顯的差異.以上研究發(fā)現(xiàn),影響菌株草甘膦抗性的EPSP合酶基因突變位點位于EPSP合酶的第1、2和3