15250.海洋來源產木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造

1、碩士學位論文海洋來源產木聚糖酶的鏈霉菌菌種篩選與代謝工程改造ScreeningandMetabolicEngineeringofMarinederivedStreptomycesStrainswithImprovedXylanaseProduction學號：21018011完成日期：窒Q!呈生墨旦壘旦大連理工大學DalianUniversityofTechnology大連理工大學碩士學位論文摘要玉米秸稈、小麥秸稈等農業(yè)廢棄物是來源豐富的

2、可再生生物質資源，利用其進行可再生清潔能源和生物基化學品的生產日益引起人們的關注。農用廢棄物的主要成分是纖維素和半纖維素，其中半纖維素占地球可再生有機碳源的三分之一，而木聚糖是半纖維素的主要成分。木聚糖的降解不僅能夠被微生物利用轉化，而且有助于纖維素與木質素的分離，在生物燃料生產和紙漿漂白等領域有重要的應用。木聚糖酶降解木聚糖以其環(huán)境友好和高效性成為木聚糖的主要降解方式。放線菌和絲狀真菌是木聚糖酶的主要生產菌，但是野生型菌株中木聚糖酶的

3、產量通常很低。因此如何提高木聚糖酶的生產水平，成為微生物育種中的關鍵問題。本文首先從大連黃海海域的小平島海泥樣品中分離獲得了八株木聚糖酶活性較好的海洋放線菌菌株，其中菌株M8和M11具有較高的木聚糖酶活性。16SrRNA分析結果表明，菌株M8的16SrRNA序列與蝕木鏈霉菌(Streptomycesxylophagus)的序列相似性達到100％；M11的16SrRNA序列與綠色產色鏈霉菌(Sviridochromogenes)的序列相似

4、性達到99％?？疾觳煌琾H條件下菌株的生長發(fā)現，M1l是一株嗜堿鏈霉菌，在pH110的高堿環(huán)境中生長良好；而菌株M8具有較好的NaCl耐受性。兩株菌株均具有較高的木聚糖酶活性，培養(yǎng)7天后酶活性分別達到876U／mL和699U／mL。酶學性質結果表明，M8木聚糖酶的最適溫度為60℃，最適pH為60；M1l木聚糖酶的最適溫度為70℃，最適pn為60。其中，M11木聚糖酶在60℃或pH5090等極端環(huán)境中表現出較好的穩(wěn)定性，且無纖維素酶活性，

5、證明該木聚糖酶有望在紙漿漂白工藝中進行應用。其次，利用核糖體工程和人工鋅指蛋白技術在細胞全局水平上對海洋鏈霉菌的木聚糖酶合成水平進行調控。本文從370株鏈霉素抗性菌株中篩選獲得了27株透明圈較大的突變體。進一步的液體酶活測試結果表明，突變菌株M111(10)的木聚糖酶產量與野生型相比提高了14％。對其核糖體S12蛋白基因(rpsL)進行擴增和測序，發(fā)現存在一個突變位點K88R。該位點位于$12蛋白的核心催化區(qū)域中，與70S核糖體復合物的

6、穩(wěn)定性及翻譯效率緊密相關，推測該位點可能是突變株酶蛋白合成水平提高的原因。在酵母菌鋅指蛋白文庫基礎上構建了以鋅指結構域為DNA結合域，Gal4為激活功能域的放線菌人工鋅指蛋白文庫。篩選獲得了高產木聚糖酶的突變體M8B32，其木聚糖酶產量與野生型相比提高了17％。對鋅指蛋白的氨基酸序列進行分析，結果表明，整合至菌株M8一B32基因組中的鋅指蛋白基因來源于人類基因組，推測該鋅指轉錄因子能夠與木聚糖酶合成相關基因的啟動子上游區(qū)域結合，調控木聚