10747.枯草芽孢桿菌穿梭表達載體和表面展示載體的構(gòu)建

1、分類號：Q墨15密級：公玨單位代碼：iQQ豎學號：2Q!l!!壘枯草芽孢桿菌穿梭表達載體和表面展示載體的構(gòu)建ConstructionoftwoexpressionshuttlevectorsandasurfacedisplayvectorforBacillussubtilis學位申請人：李志輝指導教師：檀建新教授學科專業(yè)：發(fā)酵工程學位類別：工學碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學答辯日期：二。一四年六月一日摘要枯草芽孢桿菌(Bacillussub

2、tilis)是一種極具潛力的外源蛋白表達宿主菌，不論是用來高效表達外源蛋白還是作為口服疫苗或全細胞酶的載體，都展現(xiàn)出其他細菌無可比擬的優(yōu)勢，是研究較多、應用廣泛的生物安全菌。質(zhì)粒是外源蛋白異源表達的必須工具，目前，可用于外源蛋白在丑subtilis中表達的質(zhì)粒雖然不少，但遺傳操作方便、表達效率高的Ecoli—Bsubtilis穿梭表達載體和能直接將外源蛋白展示在芽孢表面的穿梭表達載體仍然缺乏。本實驗構(gòu)建了兩個穿梭表達載體和一個表面展示的

3、載體，用4種報告基因進行了驗證，主要內(nèi)容如下：1通過融合PCR將來源于Asubtilis的木糖啟動子(PxylR)序列和來源于大腸桿菌(Escherichiacold表達載體pET21b的T7肽和多克隆位點區(qū)等序列融合替換了Ecoli丑subtilis穿梭載體pHT315的多克隆位點，構(gòu)建了一個能由D木糖誘導表達的EcoliBsubtilis穿梭表達載體pTL。PCR擴增得到了綠色熒光蛋白(GFP)基因咖，B葡萄糖苷酸酶(GUS)基因g

4、us，人淀粉樣前體蛋白(APPsw)基因彳PP刪和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)脂肪酶基因lipa，并分別插入pTL的多克隆位點構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BsubtilisWB800，獲得了工程菌WB800一gfp、WB800一gus、WB800一APPsw和WB800一lipa。熒光顯微鏡下可以觀察到WB800gfp菌體發(fā)出綠色熒光，表明GFP成功表達，用熒光分光光度法確定了檢測GFP的最佳激發(fā)波長為390nlTl，發(fā)

5、射波長為507nln；以咖為報告基因，利用熒光分光光度法經(jīng)初步優(yōu)化得到GFP在WB800gfp中誘導表達條件為：在37℃、200rpm條件下，以終濃度1％的D木糖誘導8h，GFP表達水平最高；上述條件下誘導gus、爿PPJ州、lipa基因表達，WB800一gus菌體呈現(xiàn)藍色陽性反應，WesternBlot試驗結(jié)果表明WB800APPsw菌體裂解液樣品在85kDa處有明顯的陽性蛋白雜交條帶，RashidNpNPP比色法檢測WB800一li

6、pa菌體裂解液樣品，結(jié)果顯示脂肪酶活力為7273025U／rag，較未經(jīng)木糖誘導的對照提高近210倍，表明三種基因都得到很好地表達；在無抗生素選擇壓力的條件下，質(zhì)粒pTL經(jīng)連續(xù)傳10代后仍表現(xiàn)出985％的高穩(wěn)定性。上述結(jié)果證明pTL是一個遺傳操作方便、穩(wěn)定性強、表達效率高的Ecoli丑subtilis穿梭表達載體，可以表達融合有T7肽的外源融合蛋白，不影響蛋白性質(zhì)，同時可為后續(xù)回收純化操作提供便利。2在Asubtilis的穿梭表達載體p

7、DGl48stuI的基礎(chǔ)上，經(jīng)遺傳改造構(gòu)建了一個含有Pspac啟動子的EcoliBsubtilis穿梭載體pDGl50，將克隆的加，gus，么P風w和lipa插入pDGl50構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化丑subtil&168，獲得了重組工程菌B168gfp，B168gus，B168APPsw和B1681ipa。熒光顯微鏡觀察和熒光分光光度計檢測結(jié)果表明GFP在B168一gfp中獲得表達，以咖為報告基因，利用熒光分光光度法證明用IPTG誘導B1