棉鈴蟲(chóng)蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-激素接受子3基因的特征及功能.pdf

1、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)是一種危害性極大的昆蟲(chóng)，每年都給我國(guó)及全世界造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因而它的防治工作也越來(lái)越引起人們的重視。然而，傳統(tǒng)的殺蟲(chóng)方式由于效果差、污染環(huán)境嚴(yán)重等問(wèn)題而不再適合形勢(shì)的需要。生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)就是適應(yīng)這一需要而產(chǎn)生的。其中，通過(guò)抑制其蛻皮來(lái)達(dá)到殺蟲(chóng)目的是一條較好的途徑。這就需要對(duì)棉鈴蟲(chóng)的蛻皮機(jī)理有非常詳細(xì)的了解，而整個(gè)蛻皮過(guò)程是一套復(fù)雜的涉及眾多基因參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。要全面認(rèn)識(shí)這個(gè)過(guò)程，首先

2、要選好候選基因，然后進(jìn)一步研究與之相關(guān)的基因和其他蛋白因子，以此類推，逐步掌握蛻皮過(guò)程機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)選擇的候選基因是棉鈴蟲(chóng)蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-激素接受子3基因。 激素接受子3(HormoneReceptor3)是一種蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(Molt-RegulatingTranscriptionFactor)，屬于孤兒核受體基因超家族，調(diào)控蛻皮過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)，是蛻皮相關(guān)基因早期基因簇的典型表達(dá)產(chǎn)物，可與DNA上特定的序列結(jié)合，參與蛻

3、皮激素誘導(dǎo)的晚期基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)物的調(diào)控，是蛻皮級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子。棉鈴蟲(chóng)蛻皮激素接受子3(HHR3)是HR3家族成員之一，它調(diào)控棉鈴蟲(chóng)的蛻皮過(guò)程。棉鈴蟲(chóng)HHR3基因全長(zhǎng)1668bp，即HHR3蛋白為556個(gè)aa，分子量為61.16kDa。在大腸桿菌中表達(dá)得到的是GST-HHR3融合蛋白，分子量為94kDa左右。 本人選取棉鈴蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，以已知的棉鈴蟲(chóng)蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-激素接受子3基因(HHR3)為候選基因，利用本實(shí)驗(yàn)室提供

4、的在大腸桿菌融合表達(dá)的GST-HHR3進(jìn)行了下游研究，然后提取棉鈴蟲(chóng)基因組DNA，RsaI酶切消化后加上接頭，PCR擴(kuò)增，以提高DNA片段的豐度，讓PCR產(chǎn)物與HHR3蛋白結(jié)合，再通過(guò)兔抗HHR3抗體免疫沉淀，得到結(jié)合有DNA片段的蛋白沉淀，經(jīng)三次洗滌后，酚氯仿抽提DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了證明所得到的目的DNA片段不是抗體結(jié)合的，設(shè)計(jì)了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即用PBS代替HHR3蛋白，結(jié)果沒(méi)有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明獲得的DNA片段是HHR

5、3蛋白所結(jié)合的。 為了闡明HHR3基因內(nèi)含子分布及大小情況，根據(jù)己知的HHR3基因序列，設(shè)計(jì)了多對(duì)特異性引物，再以棉鈴蟲(chóng)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)比較擴(kuò)增結(jié)果和已知HHR3基因序列，得到了一個(gè)內(nèi)含子序列，并證明了另外部分位置沒(méi)有內(nèi)含子。還有一段序列的內(nèi)含子不清楚，需要設(shè)計(jì)新的特異性引物進(jìn)行研究。 另外，本文還應(yīng)用T7SelectPhageDisplaysystem淘選了與HHR3結(jié)合的輔助蛋白因子。棉鈴蟲(chóng)表皮