環(huán)孢素A抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠大腦免疫和NF-κB通路激活的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、環(huán)孢素A抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠大腦免疫和NF-κ B通路激活的實(shí)驗(yàn)研究背景我們近幾年在臨床上開展的腎活檢、皮膚活檢和肌肉活檢都證明，糖尿病患者體內(nèi)存在廣泛的多器官免疫損傷。多年來，糖尿病的防治都是以高血糖為中心的治療策略，因此糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制和臨床處理都處于思想茫然和束手無策的尷尬境地。為弄清糖尿病發(fā)病機(jī)制，更好地從疾病的源頭預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥，作者開展了糖尿病多器官的病理免疫學(xué)的動(dòng)物研究并嘗試用環(huán)孢素A(C

2、sA)進(jìn)行干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)是整個(gè)研究的一部分。 糖尿病(DM)的主要中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)危害在于誘發(fā)腦卒中和導(dǎo)致糖尿病腦病。然而，多年來的研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥包括糖尿病CNS病變發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制。從代謝角度采用控制血糖和應(yīng)用抗氧化劑治療雖然能夠很好的控制自由基的生成，但在控制糖尿病慢性并發(fā)癥方面卻不盡人意。雖說這種觀點(diǎn)對于臨床工作有一定幫助，但仍不能從根本上為病人解除疾苦。臨床上糖尿病可伴發(fā)多種自身免疫性疾病，而

3、我們的前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠存在多器官免疫損傷，活檢發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的腎臟、皮膚和肌肉均存在免疫球蛋白的沉積，近年來許多研究也已經(jīng)提示免疫因素在DM及其并發(fā)癥發(fā)病過程中可能起到了更重要的作用。因此，我們認(rèn)為糖尿病高血糖、氧化應(yīng)激的發(fā)生與免疫因素聯(lián)系密切，糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生可能是多器官免疫損傷的結(jié)果。已經(jīng)證實(shí)大腦有相對獨(dú)立的免疫反應(yīng)系統(tǒng)。同時(shí)，糖尿病糖尿病狀態(tài)下血腦屏障(BBB)功能受損，大腦組織也容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激而

4、激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB。糖尿病狀態(tài)下，機(jī)體體液和細(xì)胞免疫異常是否激活中樞免疫系統(tǒng)，通過NF-κB及其靶細(xì)胞因子途經(jīng)導(dǎo)致了糖尿病CNS病變的發(fā)生和發(fā)展? 我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)應(yīng)用環(huán)孢素A能夠有效減少糖尿病大鼠多臟器免疫球蛋白的異常沉積和抑制多種炎性因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等的高表達(dá)，應(yīng)用CsA能否對糖尿病大鼠大腦免疫激活能否同樣有效? 目前尚未見該方面研究報(bào)道。 目的： 1

5、．從糖尿病多器官免疫損傷機(jī)制入手，觀察和研究STZ糖尿病大鼠大腦形態(tài)學(xué)變化、免疫球蛋白在大腦組織異常沉積情況、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活程度和補(bǔ)體表達(dá)情況以及CsA的干預(yù)效果。 2．從免疫和氧化應(yīng)激聯(lián)系入手，研究大腦免疫激活對氧化應(yīng)激、NF-κB及其相關(guān)細(xì)胞因子通路的影響以及CsA的干預(yù)作用。探討糖尿病大腦病變的免疫發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供一定理論依據(jù)，從而進(jìn)一步證實(shí)“感染—免疫—炎癥—器官損傷—功能障礙”是許多疾病發(fā)病的一般規(guī)律。

6、 方法： SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機(jī)分為正常對照組(CON)、單純糖尿病組(DM)、胰島素干預(yù)組(INS)和低、中、高劑量CsA干預(yù)組(ML、MM、MH)。采用尾靜脈注射STZ(50 mg/kg)的方法造模。成模后，DM組不予任何處理；INS 組給予中效胰島素皮下注射，劑量為2 IU/d～6 IU/d，使隨機(jī)血糖維持于10mmol/L 左右；ML、MM、MH組給予CsA皮下注射，劑量分別為0.5mg/kg.d

7、、1mg/kg.d和2mg/kg.d。所有動(dòng)物同期飼養(yǎng)，成模16周后處死并留取標(biāo)本。通過HE染色觀察大腦皮層、丘腦和海馬部位的形態(tài)學(xué)變化；通過免疫組化和免疫熒光方法檢測上述大腦部位IgG、IgA和IgM沉積、星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)以及補(bǔ)體C3b表達(dá)情況；測定腦組織勻漿中脂質(zhì)氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)含量和各種抗氧化酶的活性，包括總超氧化物歧化酶(T-SOD)、CuZn 超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽

8、過氧化物酶(GSH-Px)；應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察各區(qū)的NF-κB、TNF-α和MCP-1 的蛋白表達(dá)水平；利用RT-PCR技術(shù)檢測上述組織TNF-α、MCP-1mRNA 的基因表達(dá)水平。 結(jié)果： 16周DM大鼠的大腦組織HE染色未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化。與CON組比較，DM 組大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦區(qū)血管壁可見明顯 IgG、IgA沉積，大腦皮質(zhì)、丘腦和海馬區(qū) GFAP、C3b、NF-κB、TNF-α和 MCP-1 蛋白表達(dá)和TN

9、F-α mRNA和 MCP-1 mRNA 表達(dá)水平明顯增加；其組織MDA含量明顯增加，各抗氧化酶的活力均明顯下降。與DM組比較，可見CsA組上述各指標(biāo)變化均有不同程度改善，以MM、MH組為明顯。 結(jié)論： 1．糖尿病大鼠大腦組織存在IgG、IgA的沉積，是機(jī)體在STZ誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種反應(yīng)，也是免疫功能異常作用結(jié)果。CsA 能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，減少大腦血管壁Ig沉積。 2．大腦組織普遍存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和補(bǔ)體表達(dá)增