中藥復(fù)方腦得生的有效成分組研究.pdf

1、缺血性中風(fēng)屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一種多因素多途徑相互作用的疾病，涉及到大量的生物活性物質(zhì)，目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究尚未完全闡明。其病理機(jī)制主要有腦組織的能量代謝紊亂、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸神經(jīng)毒性作用、鈣超載、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)等。近年來，腦缺血的治療主要是針對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，減少梗塞面積，減少神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡等。本文以其發(fā)病機(jī)制為依據(jù)，對(duì)復(fù)方腦得生有效成分組的神經(jīng)保護(hù)作用

2、及其機(jī)制進(jìn)行了深入研究。 一、適合高通量篩選樣品的制備本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)代植物化學(xué)分離技術(shù)，制定規(guī)范的操作程序，將提取分離和層析等技術(shù)相結(jié)合，用不同溶劑對(duì)組方中原料藥進(jìn)行提取，將復(fù)方腦得生中的全部成分分為170個(gè)獨(dú)立組分。其中，對(duì)乙醇部分進(jìn)行硅膠柱層析，共計(jì)得到90個(gè)組分；對(duì)石油醚部分進(jìn)行硅膠柱層析，共計(jì)得到80個(gè)組分。所有樣品進(jìn)行濃縮供下一步的篩選及研究用。 二、對(duì)樣品進(jìn)行高通量篩選建立與腦得生功效主治相關(guān)的高通量篩選模型。

3、根據(jù)腦得生的功效主治尋找與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)共同點(diǎn)，在細(xì)胞和分子水平上建立能夠反映作用機(jī)理的篩選模型。缺血性腦損傷的發(fā)生主要與過氧化損傷、鈣超載、興奮毒性作用、炎癥反應(yīng)以及線粒體功能的受損等相關(guān)。因此，本研究中我們根據(jù)上述發(fā)病機(jī)制分別建立了相應(yīng)的損傷模型，并對(duì)所得的170個(gè)組分進(jìn)行了篩選。最后，將以上研究結(jié)果進(jìn)行匯總，發(fā)現(xiàn)部分樣品在不同模型上作用吻合，可能是腦得生發(fā)揮作用的活性物質(zhì)，另外一些樣品在多個(gè)模型作用強(qiáng)度較弱甚至相反，可能是影響腦得生療效

4、的部分。通過綜合分析，將作用符合我們要求的組分按一定比例混合組成腦得生的有效成分組(2-11，16-21，25-29，31-35，38-41，47-52，59-73，95-99，116-119，122-127，131-136，167-170)，進(jìn)行高效液相成分分析，找出適合大規(guī)模生產(chǎn)的有效成分組。 三、應(yīng)用HPLC分析高通量篩選結(jié)果，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)換分別將硅膠柱分離的醇溶部分和石油醚部分中的抗腦缺血有效成分，按其編號(hào)從其DMS

5、O溶液中取出，按照各自得率，有機(jī)混合在一起作為有效成分組供檢測(cè)用。分別將大孔樹脂分離的30％、60％、90％乙醇洗脫物部分與抗腦缺血有效成分組做對(duì)比，通過HPLC分析尋找適合大規(guī)模生產(chǎn)的目的組分。由液相色譜圖可以看出，腦得生有效成分主要分布在30％和60％乙醇洗脫物中。因此，我們將30％和60％乙醇洗脫物按比例混合作為新的復(fù)方腦得生的有效成分組(NECG)，進(jìn)行下一步的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)其療效進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制研究。 四、

6、利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行有效成分組的驗(yàn)證采用栓線法造成大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷模型，通過預(yù)防性以及治療性兩種給藥方式，從腦梗塞體積、行為學(xué)、腦組織能量代謝、病理學(xué)改變、炎癥反應(yīng)以及凋亡等多方面指標(biāo)進(jìn)行觀察，全面評(píng)價(jià)了我們所確證的有效成分組的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，治療性給藥時(shí)NECG大劑量組(0.07 g/kg)可顯著降低腦梗死體積、改善神經(jīng)功能，并且可抑制炎癥反應(yīng)，以及凋亡的發(fā)生和發(fā)展；NECG中劑量組(0.02 g/kg)和小劑量組(0.00

7、7 g/kg)也有改善作用，但某些指標(biāo)與模型組相比，沒有顯著性差異(P>0.05)。造模前先連續(xù)給予7天藥物時(shí)，與模型組以及治療給藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比，藥物的保護(hù)作用則更加明顯，尤其NECG中劑量組表現(xiàn)出了明顯的保護(hù)作用。另外，我們同時(shí)與原方的療效進(jìn)行了對(duì)照研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明NECG的療效明顯優(yōu)于原方。 五、體外對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)一步探討 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NECG對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)理不是單一的，其藥效是多種機(jī)理綜合作用的結(jié)果。

8、 1、NECG能抑制過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NECG可顯著改善過氧化氫引起的細(xì)胞存活率的降低；流式細(xì)胞儀分析表明100μg/ml和10μg/ml的NECG均能顯著改善過氧化氫引起的凋亡；Western Blotting的分析結(jié)果顯示，100μg/ml和10μg/ml NECG能夠明顯抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)的下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)，使Bcl-2/Bax比值上升，還能明顯抑制細(xì)胞色素C從線粒體的

9、釋放以及p53的活化；同時(shí)，預(yù)先加入NECG還可明顯抑制過氧化氫損傷引起的caspase-3的活化，使其活性降低。 2、NECG能夠抑制疊氮鈉誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先證明了疊氮鈉誘導(dǎo)的凋亡伴隨有細(xì)胞內(nèi)ROS時(shí)間依賴性的產(chǎn)生增多，并且與凋亡的線粒體途徑改變密切相關(guān)。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，NECG可劑量依賴性的顯著改善上述改變：NECG可改善細(xì)胞存活率和凋亡率，降低細(xì)胞內(nèi)ROS的增多，looμg／ml和10μ

10、g／ml的NECG能夠抑制疊氮鈉誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)的下調(diào)和Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)，使Bcl-2和Bax比值上調(diào)，預(yù)先加入NECG能明顯抑制疊氮鈉損傷引起的細(xì)胞色素C自線粒體的釋放以及caspase-3的活化，從而有效的降低了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 3、NECG有改善線粒體功能的作用。NECG體外能夠抑制50μmoL／L FeSO<,4>／500pmoL/L半胱胺酸損傷體系誘導(dǎo)的線粒體MDA生成的增加，降低脂質(zhì)過氧化的發(fā)生率，具有明顯的

11、保護(hù)線粒體免遭氧化損傷的作用；可減輕線粒體腫脹度，維持線粒體的膜電位，抑制H<'+>-ATP酶活性的降低，從而保護(hù)了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能；NECG還可抑制GSH含量的降低，保護(hù)了線粒體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，從而使氧自由基的生成與清除保持平衡，使線粒體膜免遭損傷。因此，NECG抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制一方面和清除氧自由基有關(guān)，另一方面NECG可能通過直接影響p53的表達(dá)，細(xì)胞色素C的釋放、caspase-3活性或者通過調(diào)控Bcl-2、Bax的蛋白表

12、達(dá)間接影響線粒體依賴的caspase-3途徑來抑制細(xì)胞凋亡。 六、結(jié)論 研究結(jié)果表明，中藥復(fù)方腦得生對(duì)腦缺血有顯著的防治作用，這種作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其中多種有效成分的有機(jī)組合，這些成分通過不同的作用途徑和相互影響，產(chǎn)生綜合作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血疾病的預(yù)防和治療作用。藥效成分組的作用機(jī)制研究證明中藥有效成分組通過不同的成分從不同的途徑發(fā)揮作用，如抗過氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡以及減輕炎癥反應(yīng)等。結(jié)果證明有效成分組可以比較合理的代表了