亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及Rho GDI 1和2的作用.pdf

1、已有的大量生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明：微量元素硒將是抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域一個(gè)很有前途的研究熱點(diǎn)。近年來已經(jīng)有研究報(bào)道，多種硒化合物在超營養(yǎng)濃度時(shí)可以在體外刺激腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和生長阻滯，其具體機(jī)制隨著細(xì)胞類型和硒化合物的種類不同而有明顯的區(qū)別。前期研究也表明，亞硒酸鈉在較高濃度時(shí)(5-20μM無毒范圍內(nèi))，能夠有效抑制人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞的生長增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，此作用在一定范圍內(nèi)呈濃度、時(shí)間依賴性。本文利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，研

2、究針對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞凋亡過程中，蛋白表達(dá)的整體變化，這對(duì)于解釋該過程的分子事件以及腫瘤的生物學(xué)行為具有重要的提示和指導(dǎo)作用。選用人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞，用20μM亞硒酸鈉處理細(xì)胞易誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)用未經(jīng)亞硒酸鈉處理的細(xì)胞作為對(duì)照，制備細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雙向電泳，在全蛋白圖譜中發(fā)現(xiàn)了35個(gè)差異表達(dá)(≥1.5倍)的蛋白點(diǎn)，共鑒定了30個(gè)差異蛋白，其中誘導(dǎo)凋亡后表達(dá)降低的26個(gè)，凋亡后表達(dá)增加的有4個(gè)，對(duì)差異蛋白進(jìn)

3、行文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)了參與到能量代謝，應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞骨架，蛋白質(zhì)分解代謝，核酸分解代謝以及涉及一些重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控子如Rho GDPdissociationinhibitor 1、2(Rho GDI1、2)。6小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)多時(shí)段的蛋白質(zhì)組圖譜比較發(fā)現(xiàn)涉及DNA損傷的蛋白dUTP pyrophosphatase和ubiquitin-conjugatingenzyme E2N在三個(gè)時(shí)段均表達(dá)降低，結(jié)合亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞

4、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)的電鏡結(jié)果圖片顯示的凋亡進(jìn)程中的細(xì)胞形態(tài)，推測核損傷是這一凋亡進(jìn)程中的早期事件，硒誘導(dǎo)凋亡過程中DNA損傷有早期重要作用。 在比較蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定結(jié)果中，Rho GDIs是調(diào)節(jié)RhoGTPase的一大類調(diào)節(jié)蛋白，在正常細(xì)胞的生長和惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。應(yīng)用caspase2、3不同的抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，caspase 3的抑制劑并不能阻止Rho GD11被切割成小片段，而caspas

5、e 2的抑制劑能夠阻止小片段切割產(chǎn)物的生成，這至少說明Rho GDI1不是caspase3的底物。單獨(dú)提取對(duì)照和20μM亞硒酸鈉誘導(dǎo)凋亡36小時(shí)的NB4細(xì)胞的核蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，Rho GDI1、2在凋亡后的細(xì)胞核中的表達(dá)量有明顯增加，免疫熒光和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凋亡后的Rho GDI2有明顯的轉(zhuǎn)位到核的現(xiàn)象，但沒有發(fā)現(xiàn)Rho GDI1有明顯的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。在人急性粒細(xì)胞白血病中，過量表達(dá)的Rho GDI

6、 2可能也與這些細(xì)胞惡性顯型的特殊本質(zhì)相關(guān)，包括增殖的入侵性和轉(zhuǎn)移性。我們對(duì)Rho GDI1、2進(jìn)行siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，流式檢測的結(jié)果表明干擾后亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的凋亡率有所下降，因此Zhang et al．提出的RhoGDI 1抑制凋亡的假說在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)在不能成立。Rho GDI1和RacGTP酶形成穩(wěn)定的混合物(將Rac保留在非活性的胞漿存在形式)，這種復(fù)合物的解離，作為活化Rac的前提條件，這是Rho GDI1磷酸化作用

7、而不是置換因子ERM家族的成員的作用。為尋找與Rho GDI1、2相互作用的蛋白，在所進(jìn)行的免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了存在Gelosin蛋白。Gelosin蛋白在20μM亞硒酸鈉誘導(dǎo)凋亡36小時(shí)的NB4細(xì)胞表達(dá)降低，并且其作為caspase3底物的切割產(chǎn)物也有所增加，切斷肌動(dòng)蛋白絲，產(chǎn)生核片斷化，這可能是凋亡過程的重要事件，影響細(xì)胞形態(tài)變化和凋亡進(jìn)程。上述研究結(jié)果對(duì)于深入了解亞硒酸鈉誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡機(jī)制給出了重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)下一步的探索