外源性熱原對體外人全血中IL-6細(xì)胞因子含量的影響.pdf

1、自1982年Gordon W.Duff[1]和Elisha Atkins[2]提出基于人體發(fā)熱反應(yīng)機(jī)制的體外熱原試驗(yàn)，利用人體血細(xì)胞與外源性熱原接觸時，可誘導(dǎo)血細(xì)胞釋放內(nèi)源性熱原(IL-1，IL-6，TNF-a等細(xì)胞因子)這一原理[3]，為熱原檢查研究提供了新的課題。 目的：建立人全血IL-6因子熱原檢查法。 方法：采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELSIA)，測定不同濃度細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)在不同條件下與人全血反應(yīng)時，IL-6因

2、子釋放量的變化。 結(jié)果： 1、新鮮抗凝人全血IL-6因子熱原檢查法條件的確定 血液與供試品的反應(yīng)時間為6小時；血液的適宜保存溫度為4℃；血液保存時間為4小時；血液的稀釋倍數(shù)為4倍；加樣體積比確定為血液：供試液=4：1；LPS在0.01～40EU/ml濃度范圍內(nèi)，刺激血細(xì)胞釋放IL-6細(xì)胞因子量，與LPS濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)，r=0.982。 2、人全血的低溫凍存和融化時條件優(yōu)化 選用10％DMSO

3、(V/V)溶液為血液低溫凍存保護(hù)劑；新鮮血液加入保護(hù)劑到低溫凍存時間不宜超過90min。在37℃條件下快速融化的凍存血液，與LPS共培養(yǎng)時，IL-6細(xì)胞因子的生成量明顯高于4℃和室溫(25℃)下融化的血液(p<0.05)，融化血液至培養(yǎng)時間應(yīng)小于30min；當(dāng)LPS濃度為0.5EU/ml時，在4℃、室溫(25℃)和37℃條件下融化的凍存血液生成IL-6因子的OD值分別為0.127±0.004、0.163±0.006、0.353±0.00

4、4。 3、不同個體的混合血液對LPS的反應(yīng) 混合血液與LPS的反應(yīng)時間為12小時：不同個體血樣采用混合后凍存與凍存融化后混合兩種方法，兩種混勻后血液對LPS刺激產(chǎn)生的IL-6與不同個體血樣對LPS刺激產(chǎn)生的IL-6平均值均無顯著性差別(P>0.05)；混合后血樣對三個不同批號LPS反應(yīng)無顯著差別(P>0.05)；在90天內(nèi)混合血樣與0.5EU/mlLPS反應(yīng)結(jié)果顯著高于0.9％氯化鈉注射液，反應(yīng)靈敏度均大于600％，說明

5、在這期間，混合血樣能保持穩(wěn)定，且對LPS刺激反應(yīng)靈敏度沒有降低。 4、人全血IL-6因子熱原檢查法的應(yīng)用 應(yīng)用人全血對丹參注射液、甘草酸二銨注射液和注射用氨芐西林鈉三種藥品進(jìn)行熱原檢測，在最大有效稀釋倍數(shù)內(nèi)，通過稀釋找出他們的最小干擾濃度分別為16倍、4倍、8倍稀釋液，外加0.5 EU/ml LPS標(biāo)準(zhǔn)品，回收率分別為71.2％、77.4％、115.0％。檢測結(jié)果與家兔法、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相一致，且可定量。 結(jié)論