糖尿病腎病細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡機(jī)制及藥物干預(yù)的研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）最常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥，是終末期腎病的主要原因之一。糖尿病腎病的病變特征為腎小球系膜基質(zhì)積聚和基底膜增厚。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的成分與含量取決于基質(zhì)合成與降解兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡。近年來(lái)的研究顯示ECM降解能力下降在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是負(fù)責(zé)ECM降解的主要酶系，其中MMP-2（又稱(chēng)明膠酶A）主要參與Ⅳ型膠原的降解，而后者是DN中腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)堆積的

2、主要成分，因此與DN的關(guān)系最為密切。關(guān)于MMP-2及其組織抑制物（TiMP-2）在DN中的作用存有較多爭(zhēng)議，而且關(guān)于MMP-2酶原的特異膜型激活因子-膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）在DN中的表達(dá)及作用鮮見(jiàn)研究。
　　 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）下游重要效應(yīng)分子，因其較強(qiáng)的致纖維化作用，且生物效應(yīng)較單一成為DN研究的熱點(diǎn)。目前有關(guān)CTGF在糖尿病腎病ECM代謝障礙中的作用機(jī)制鮮有深入研究報(bào)

3、道。
　　 腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的激活，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的增加是DN發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制AngⅡ的產(chǎn)生并干擾其作用是DN治療的關(guān)鍵。厄貝沙坦是血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（AT1Ra），其腎臟保護(hù)作用是否涉及細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 TGF-β1誘導(dǎo)ECM代謝失衡在組織纖維化進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用。TGF-β1的各種生物效應(yīng)是依靠其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中最重要的是Smads（Sma an

4、d Mad protein）蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。由于Smad2及Smad3具有較高同源性，在以往的研究中很難區(qū)分。RNA干擾（RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型基因靜默技術(shù)，該技術(shù)具有高度的序列專(zhuān)一性，能簡(jiǎn)單、高效地阻抑特定基因的表達(dá)。
　　 本研究以糖尿病大鼠模型和體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMCs）為對(duì)象，從整體、細(xì)胞和分子水平，系統(tǒng)觀察CTGF、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表達(dá)的變化，并通過(guò)RNAi分別敲低系膜細(xì)

5、胞Smad2和Smad3蛋白表達(dá)，以探討TGF-β1/Smad信號(hào)通路在糖尿病性ECM代謝失衡中的作用。通過(guò)厄貝沙坦對(duì)動(dòng)物及細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)探討AT1Ra對(duì)腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.糖尿病動(dòng)物模型制備及相關(guān)指標(biāo)觀察
　　 雄性Wistar大鼠42只，戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40mg/kg）后行右腎切除術(shù)。2周后將大鼠隨機(jī)分為三組：右。腎切除對(duì)照組（n=18），糖尿病組（DM.n=18）和厄貝沙坦干預(yù)

6、組（DM+Irb，n=6）。其中DM組和厄貝沙坦干預(yù)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，65 mg/kg溶于0.1mol/L枸椽酸緩沖液中，pH值4.5），對(duì)照組只注射相同體積的枸櫞酸緩沖液，48h后尾尖取血，血糖儀測(cè)定血糖，尿糖試紙測(cè)定尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型。厄貝沙坦干預(yù)組給予厄貝沙坦50mg.kg-1·d-1灌胃，連續(xù)給藥12周。對(duì)照組和DM組只用等量生理鹽水灌胃。厄貝沙坦干預(yù)組大鼠于

7、給藥12周后，對(duì)照組和DM組分別于注射STZ后4、8和12周每組取6只大鼠，收集血尿標(biāo)本，切取腎臟，光鏡觀察。腎臟一般病理改變，免疫組化檢測(cè)腎組織MMP-2、TIMP-2和CTGF蛋白表達(dá)，以Western blot和RT-PCR.分別檢測(cè)腎組織MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 2.大鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)和相關(guān)指標(biāo)觀察
　　 用含10％胎牛血清及100KU/L青霉素、10

8、0mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞。細(xì)胞分為低糖組（LG組：5.5 mmol/L葡萄糖），滲透壓對(duì)照組（LG+M組：5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇），高糖組（HG組：30 mmol/L葡萄糖）和厄貝沙坦組處理組（HG+Irb組）。LG組、LG+M組和HG組分別刺激24h、48h、72h、96h。HG+Irb組設(shè)3個(gè)濃度，分別為：10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，刺激

9、時(shí)間為48h；然后選擇濃度10-5Smol/L，刺激24h、48h、72h、96h。于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Western blot和RT-PCR檢測(cè)MMP-2、TiMP-2、MT1-MMP和CTGF蛋白和mRNA的表達(dá)，并用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中Ⅳ型膠原的含量。
　　 3.RNA干擾及相關(guān)指標(biāo)觀察
　　 針對(duì)大鼠Smad2和Smad3編碼序列分別設(shè)計(jì)3條體外轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA（siRNA）。優(yōu)化

10、轉(zhuǎn)染條件后將siRNA分別轉(zhuǎn)染入系膜細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常和陰性對(duì)照，于轉(zhuǎn)染結(jié)束后48小時(shí)收集細(xì)胞，提取蛋白，分別檢測(cè)Smad2、Smad3和Smad4的蛋白表達(dá)量，確定敲低效果最佳的siRNA，并確認(rèn)Smad2與Smad3的siRNA對(duì)相互間靶基因無(wú)交叉抑制，同時(shí)對(duì)Smad4也無(wú)抑制。隨后將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24h后待細(xì)胞融合50％-60％開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白細(xì)胞對(duì)照孔、TGF-β1刺激孔、陰性對(duì)照+TGF-β1孔（轉(zhuǎn)染

11、陰性對(duì)照siRNA）、Smad21+TGF-β1孔（轉(zhuǎn)染Smad21 siRNA）、Smad33+TGF-β1孔（轉(zhuǎn)染Smad33 siRNA）、Smad21+Smad33+TGF-β1孔（轉(zhuǎn)染Smad21和Smad33siRNA）。轉(zhuǎn)染后除空白對(duì)照組外，其余各組均經(jīng)2ng/ml TGF-β1刺激48h后收集細(xì)胞提取蛋白和RNA，用Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)各組MMP-2、TiM：P-2、MT1-MMP和CTGF的蛋

12、白和mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：①動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DN中MMP-2表達(dá)下調(diào)和活性下降伴有MT1-MMP表達(dá)減少和TIMP-2表達(dá)增多，提示MMP-2調(diào)控異常，引致其降解能力下降是導(dǎo)致ECM代謝障礙并發(fā)展為腎小球硬化的原因之一。②DN中CTGF表達(dá)增加，且與MMP-2/TIMP-2比值呈負(fù)相關(guān)，提示CTGF在DN中可能具有抑制ECM降解的作用。③厄貝沙坦能夠減輕糖尿病大鼠腎臟病變，改善腎功能，同時(shí)減少糖尿病大鼠腎組織和系膜細(xì)