OSX基因修飾的骨髓MSCs促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景與目的]
　　 牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)技術(shù)最早源于矯形外科,用來(lái)矯正肢體長(zhǎng)度缺陷,后來(lái)用于治療顱頜面的先天畸形。牽張成骨成功引入口腔頜面外科為常規(guī)技術(shù)難以矯正的骨缺損和畸形提供了新的方法和思路,它的臨床實(shí)踐效果不僅突破了傳統(tǒng)外科理論而且解決了許多傳統(tǒng)外科手段所無(wú)法解決的臨床難題。
　　 牽張成骨過程中形成新骨的形態(tài)與、結(jié)構(gòu)和大小接近周圍原骨,無(wú)需植骨,避免了骨移植術(shù)的各種

2、并發(fā)癥；骨周圍的軟組織,如肌肉、皮膚、神經(jīng)和血管,可同期同步擴(kuò)張；此外,牽張成骨手術(shù)創(chuàng)傷小。但牽張成骨的某些局限性如治療周期長(zhǎng)、牽張過快過長(zhǎng)導(dǎo)致新骨形成不良等問題限制了其在臨床上的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。因此,如何促進(jìn)牽張新骨形成與礦化,從而縮短牽張成骨治療周期正成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 目前,許多方法被嘗試用于促進(jìn)牽張成骨過程中新骨和骨痂形成,縮短DO固定期。這些方法包括應(yīng)用脫礦骨基質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、低強(qiáng)度超聲、直流電、電磁場(chǎng)刺激、高

3、壓氧、干細(xì)胞和細(xì)胞因子等。雖然上述方法獲得了一定的效果,但這些手段均未獲得廣泛的臨床應(yīng)用。
　　 很多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子已被證實(shí)促進(jìn)體內(nèi)骨再生,研究最多的是骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)家族,在不同動(dòng)物模型上都表明可以促進(jìn)牽張間隙異位成骨,其中BMP-2和BMP-7已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于骨不連的病人。其他誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)和分化細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggr

4、owth factor-beta1,TGF-β1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast
　　 growth factor,bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growthfactor-1,IGF-1)等也對(duì)新骨生成有一定促進(jìn)作用。但這些外源性應(yīng)用的生長(zhǎng)因子數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生理劑量才能發(fā)揮成骨的作用,可能與其半衰期短和導(dǎo)入途徑有關(guān)。此外,細(xì)胞因子超生理劑量的應(yīng)用不僅費(fèi)用高昂,限制了臨床廣

5、泛的應(yīng)用,而且導(dǎo)致臨近的非骨組織異位成骨。鑒于這些并發(fā)癥,基于生長(zhǎng)因子過表達(dá)策略的基因治療成為促進(jìn)成骨的一種新的策略。
　　 以BMP-2、BMP-7和bBGF為目的基因的基因治療已用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并成功的促進(jìn)牽張成骨新骨形成。但是這種使骨生長(zhǎng)因子過表達(dá)的基因治療策略,對(duì)周圍非骨組織的旁分泌導(dǎo)致的復(fù)雜的釋放動(dòng)力學(xué)和無(wú)法調(diào)控的異位成骨阻礙了這一方法在臨床的應(yīng)用。此外,牽張成骨中新骨形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,是多因素、多細(xì)胞因子共同參與

6、的過程,而讓多種生長(zhǎng)因子同時(shí)高表達(dá)有一定困難。
　　 因此,我們?cè)O(shè)想了從眾多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和動(dòng)力傳導(dǎo)的中樞和靶向,即轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的水平尋找牽張成骨基因治療的一種新方法,以避免基于骨生長(zhǎng)因子基因治療的一些弊端。
　　 轉(zhuǎn)錄因子,包括Runx2,Smads,Dlx-3,Dlx-5,MSX-2,AP-1和Osterix(OSX)都在骨愈合過程中表達(dá),但在這些成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子中,Runx2和Osterix是多潛能骨髓基質(zhì)干

7、細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的必不可少的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Runx2屬于runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族,在成骨部位高表達(dá),在骨形成中發(fā)揮著重要作用。Runx2過表達(dá)在成骨早期能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,但可能抑制成骨細(xì)胞的晚期分化。OSX是一種具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,位于Runx2的下游,OSX的過表達(dá)能誘導(dǎo)有成骨潛能的細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,補(bǔ)充成骨細(xì)胞來(lái)源,抑制軟骨細(xì)胞形成,促進(jìn)新骨的成熟和礦化,避免了Runx2抑制成骨細(xì)胞的晚期分化的問題。而國(guó)際上也

8、尚未查見關(guān)于OSX基因治療用于牽張成骨的報(bào)道。
　　 因此,在本研究中選擇OSX為目的基因,首先建立兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動(dòng)物模型,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組質(zhì)粒pEGFP-OSX瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MSCs,將OSX修飾的MSCs導(dǎo)入到兔下頜牽張間隙中;應(yīng)用影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計(jì)量學(xué)等手段與對(duì)照組比較,評(píng)價(jià)OSX局部基因治療對(duì)牽張成骨中新骨的形成和礦化的作用,并檢測(cè)BSP體內(nèi)表達(dá)情況。本研究結(jié)果將為OSX基因治療策

9、略促進(jìn)牽張成骨新骨形成和縮短牽張成骨療程提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為最終的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.兔單側(cè)下頜骨牽張成骨動(dòng)物模型的建立:選擇新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,4～5個(gè)月齡,3.0～3.5 kg,雌雄不限。使用改進(jìn)的內(nèi)置式牽張器,由螺旋牽張桿、導(dǎo)向滑動(dòng)桿、固定臂、旋轉(zhuǎn)柄以及連結(jié)旋轉(zhuǎn)柄的方向關(guān)節(jié)等組成,每旋轉(zhuǎn)一圈,牽張距離為0.4mm.用戊巴比妥鈉在兔耳緣靜脈注射麻醉后,在下切牙與后牙之間約1公分的區(qū)域內(nèi)

10、選擇截骨部位,骨切開后用4個(gè)鈦螺釘固定牽張成骨器。6天的延遲期后,進(jìn)行牽張,速度為0.8mm/天(上午8:00.,4rm,下午8:0,0.4mm),連續(xù)10天,共牽張延長(zhǎng)8mm,牽張結(jié)束后固定牽張器。分別于固定期開始的第2、6周處死一半動(dòng)物。動(dòng)物處死后下頜骨標(biāo)本行X線檢查和組織學(xué)HE染色觀察。
　　 2.pEGFP-OSX的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增獲得目的基因,經(jīng)過純化、酶切、酶切產(chǎn)物回收與純化制備目的基因。載體進(jìn)行酶切消化后將酶切產(chǎn)物

11、回收、純化,使載體線性化。然后將獲得的目的基因連接到載體,制備感受態(tài)、轉(zhuǎn)化,將構(gòu)建的新質(zhì)粒PCR擴(kuò)增,測(cè)序鑒定。
　　 3.兔自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)和傳代,采用密度梯度離心法,取生長(zhǎng)良好第3代細(xì)胞用于基因轉(zhuǎn)染和治療。
　　 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染MSCs和基因治療:取與每只兔相對(duì)應(yīng)的第3代骨髓MSCs,消化計(jì)數(shù),并傳代至6孔板內(nèi),用以作基因轉(zhuǎn)染。細(xì)胞傳代24h后,細(xì)胞達(dá)到80％融合

12、,此時(shí)采用脂質(zhì)體法進(jìn)行pEGFP-OSX基因轉(zhuǎn)染操作,通過熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率來(lái)觀察轉(zhuǎn)染后OSX基因的表達(dá)。分別用pEGFP-OSX修飾的MSCs(A組,18只),MSCs(B組,18只)和生理鹽水(C組,18只),在牽張結(jié)束后立即對(duì)兔牽張間隙多點(diǎn)注射治療。
　　 5.成骨效果檢測(cè):于牽張結(jié)束第2周和第6周隨機(jī)處死各9只動(dòng)物,標(biāo)本獲取后立即行X線檢查,然后檢測(cè)牽張區(qū)骨密度。每個(gè)標(biāo)本制作不連續(xù)切片16張,10張用以HE染色,在

13、光鏡下觀察并進(jìn)行形態(tài)計(jì)量學(xué)分析;6張用以免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨涎蛋白(BSP)表達(dá)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)采用圖像分析軟件進(jìn)行分析。每一標(biāo)本均測(cè)量10張不連續(xù)切片,測(cè)量結(jié)果的均數(shù),為該標(biāo)本的測(cè)量參數(shù)值。測(cè)量參數(shù)包括新生骨量和新生骨小梁厚度。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)中牽張間隙骨密度、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。對(duì)每一時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)的組間差異應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行單因素的方差分析。P<0.05差異具有顯著性。

14、>　　 [結(jié)果]
　　 1.活體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,均耐受手術(shù)及術(shù)后牽張,飲食大小便正常,牽張結(jié)束后存在偏頜現(xiàn)象。大體標(biāo)本發(fā)現(xiàn)牽張側(cè)下頜骨延長(zhǎng)。標(biāo)本X線檢查和組織學(xué)觀察證實(shí)動(dòng)物模型牽張間隙成骨良好,下頜骨按照預(yù)定目標(biāo)延長(zhǎng)。
　　 2.通過基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-OSX,測(cè)序分析證實(shí)了pEGFP-OSX質(zhì)粒的正確性。
　　 3.應(yīng)用密度梯度離心法成功分離兔骨髓MSCs,脂質(zhì)體介導(dǎo)的pEGFP-OSX

15、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染骨髓MSCs,熒光顯微鏡下觀察48小時(shí)的轉(zhuǎn)染效率為40-45％。
　　 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,OSX基因修飾的自體骨髓MSCs治療組(A組)比MSCs治療組(B組)顯示出更好的成骨和礦化,自體骨髓MSCs治療組也比生理鹽水注射組(C組)表現(xiàn)出更好的骨痂形成。骨密度和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)后,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與上述一致,A組顯著優(yōu)于B組(P<0.05),B組顯著優(yōu)于C組(P<0.05)。
　　 5.免

16、疫組織化學(xué)檢測(cè)表明在牽張結(jié)束第2周時(shí)A組中多數(shù)間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和新生的骨基質(zhì)均有BSP強(qiáng)染色,B組BSP染色較淺,C組染色最淺。
　　 [結(jié)論]
　　 1.內(nèi)置式牽張器能夠滿足兔單側(cè)下頜骨延長(zhǎng)的要求,牽張成骨的延遲期成骨與骨折愈合過程類似,但是牽張期和固定期骨再生具有特征性的組織學(xué)變化。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)成功建立了穩(wěn)定的兔單側(cè)下頜骨牽張成骨的動(dòng)物模型,重復(fù)性高,適合大批量動(dòng)物實(shí)驗(yàn),為細(xì)胞和基因治療提供了良好的

17、實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 3.密度梯度離心法所獲MSCs具有很強(qiáng)的體外增值活性,是進(jìn)行細(xì)胞治療和基因治療的理想種子細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察,脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以使pEGFP-OSX基因在MSCs中成功表達(dá),但轉(zhuǎn)染效率很低。
　　 4.X線、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察都證實(shí),與單純MSCs及生理鹽水比較,pEGFP-OSX修飾的MSCs可更有效促進(jìn)兔下頜牽張成骨過程中新骨形成和礦化,提示OSX基因治療是促進(jìn)下頜骨牽張成骨行之有效的