我國養(yǎng)殖太平洋牡蠣中諾瓦克樣病毒的檢測(cè)及部分核酸序列的分析.pdf

1、諾瓦克樣病毒(Norwalk-likeviruses，NLVs)是一組形態(tài)和生物學(xué)特征類似的無包膜的正的單鏈RNA病毒的統(tǒng)稱。其形態(tài)微小，圓形，直徑為26-35nm，屬于杯狀病毒科。根據(jù)病毒RNA聚合酶區(qū)或衣殼蛋白核苷酸和氨基酸序列的同源性比較，將NLVs分為3個(gè)基因組：基因Ⅰ組(代表株NV)、基因Ⅱ組(代表株SMA)、Sapporovirus。美國聯(lián)邦疾病控制中心(CentersforDiseaseControlandPreventi

2、on，CDC)對(duì)1976-1980年腹瀉流行的調(diào)查報(bào)告表明約有42％的胃腸炎暴發(fā)與NLVs有血清學(xué)聯(lián)系。NLVs能耐受不良的外界環(huán)境、感染持續(xù)時(shí)間長，且僅10-100個(gè)病毒粒子就能引起感染，所以說它的危害性不可低估。我國1995年從患兒的糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了第一例NLVs。靖宇等人曾經(jīng)應(yīng)用免疫酶聯(lián)技術(shù)從北京市醫(yī)院門診非細(xì)菌性腹瀉病人的血清標(biāo)本中檢測(cè)到NLVs，廣州也有生食NLVs污染的蟹肉引發(fā)的急性胃腸炎的報(bào)道，這都說明在我國NLVs是存在

3、的。美國和日本已報(bào)道了大量由于生吃貝類食物而暴發(fā)的NLVs感染引起的流行性胃腸炎。我國是水產(chǎn)品大國，每年都養(yǎng)殖大量的貝殼類水產(chǎn)品，尤其牡蠣是我國第一大養(yǎng)殖貝類，產(chǎn)量居貝類首位。每年我國都會(huì)向日本等國出口大量的牡蠣，此外在我國江浙沿海地區(qū)，人民喜歡生食貝類等海產(chǎn)品。因而建立一種快速的檢測(cè)方法，一方面可以避免疾病的發(fā)生，保護(hù)人們的健康，另一方面，也可以監(jiān)控出口海產(chǎn)品的質(zhì)量。 到目前為止國內(nèi)還沒有關(guān)于檢測(cè)養(yǎng)殖牡蠣中諾瓦克樣病毒存在情況

4、的相關(guān)報(bào)道。本論文利用pH9.5的甘氨酸緩沖液性處理牡蠣勻漿液，PEG沉淀病毒粒子的方法對(duì)未知的是否污染有諾瓦克樣病毒的牡蠣樣品進(jìn)行處理，并提取病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR法對(duì)37份牡蠣樣品進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)到6個(gè)陽性樣品。從2002年11月到2003年4月份這一期間內(nèi)所采集的牡蠣樣品中，分離出的NLVs最多，說明冬天為牡蠣污染NLVs的高峰期。對(duì)于其中的糞便陽性樣品和牡蠣分離樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接及轉(zhuǎn)化，獲取重組克隆并測(cè)序。重

5、組質(zhì)粒序列測(cè)定結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTn序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些病毒分離株均屬于GⅡ型。且與GeneBank上的日本株的同源性較高(＞94％)。這說明了地理關(guān)系上較近的NLVs之間的同源性較高。這就為設(shè)計(jì)公共引物提供了基礎(chǔ)。六個(gè)病毒株的RNA聚合酶區(qū)部分237個(gè)堿基序列之間的相似度為79.2％.其中糞便樣品與日本牡蠣樣品的相似度為77.0％，而與其他4個(gè)牡蠣樣品的相似度較低，分別為56.7％、56.1％、57.3％和65.3％。日本牡蠣樣

6、品與本試驗(yàn)中的牡蠣樣品之間的相似度略高于糞便樣品，分別為72.4％、73.6％、73.0％和79.4％。而本試驗(yàn)中分離得到的四個(gè)病毒株之間的相似度為95.5％。尤其是1、3、5號(hào)樣之間的相似度高達(dá)99.0％以上。由此我們推斷從中國牡蠣樣品中分離出的幾個(gè)病毒株之間同源性高，可以認(rèn)為是一種基因型的病毒。而與日本的病毒株之間存在較顯著的差異，和糞便分離株之間存在明顯差異。糞便分離株、日本牡蠣分離株和中國牡蠣分離株之間RNA聚合酶部分序列的差異

7、性也說明了NLVs在遺傳上的多樣性。其中日本牡蠣分離株與Lordsdalevirus(X86557)在遺傳上比較接近；中國的4個(gè)牡蠣分離株與Mexicovirus(U22498)在遺傳上比較接近。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果，我們又進(jìn)行了寡核苷酸探針雜交試驗(yàn)。根據(jù)已發(fā)表的NLVs的RNA聚合酶區(qū)的序列設(shè)計(jì)了一條生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針。用該探針對(duì)我們的病毒分離株的RT-PCR產(chǎn)物和插入有這些產(chǎn)物片段的質(zhì)粒菌進(jìn)行雜交試驗(yàn)

8、，結(jié)果與RT-PCR一致。通過寡核苷酸探針雜交試驗(yàn)，我們可以不用再做克隆、測(cè)序和序列比對(duì)工作，就可以驗(yàn)證RT-PCR的結(jié)果，排除假陽性的結(jié)果。這對(duì)于只做一般樣品檢測(cè)的工場和實(shí)驗(yàn)室，尤其是對(duì)于大批量樣品檢測(cè)來說，在確保結(jié)果的正確性的基礎(chǔ)上節(jié)省了開支和時(shí)間。 因?yàn)镹LVs至今仍無法通過細(xì)胞培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，所以無法通過一般常用的方法進(jìn)行定量分析。我們建立了一個(gè)基于RT-PCR的檢測(cè)諾瓦克樣病毒的定量分析試驗(yàn)方法。通過該試驗(yàn)我們