CLN8P相互作用蛋白質(zhì)篩選、真核表達(dá)及檢測.pdf

1、目的CLN8是神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(theneuronalceroidlipofuscinoses，NCLs)這一疾病群中的一個(gè)致病基因。關(guān)于其功能知之甚少。我們采用酵母雙雜交技術(shù)，篩選人胎腦cDNA文庫表達(dá)產(chǎn)物中與CLN8P相互作用的分子，初步探討CLN8P的功能，為其在發(fā)病機(jī)制中的作用提供新線索. 方法將CLN8構(gòu)建到酵母雙雜交系統(tǒng)中的pLexA載體，檢測該重組質(zhì)粒對報(bào)告基因LacZ的自激活作用。通過酵母雙雜交方法，從人胎

2、腦cDNA文庫表達(dá)產(chǎn)物中篩選與CLN8P相互作用的分子，提取陽性克隆質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析。 結(jié)果成功構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)plexA-CLN8誘餌質(zhì)粒，誘餌質(zhì)粒對報(bào)告基因LacZ無自激活作用，篩選到41個(gè)陽性克隆。序列測定表明，其中有一個(gè)陽性克隆編碼人NADH脫氫酶亞單位5。 結(jié)論1、CLN8P與ND5在酵母細(xì)胞中有相互作用?！　?、ND5與CLN8P結(jié)合，可能是造成脂褐質(zhì)線粒體ATP合酶亞基C積聚的新　

3、　機(jī)制之一?！　〉诙糠諧LN8基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及檢測 目的構(gòu)建真核表達(dá)載體，為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證CLN8與ND5是否存在相互作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CLN8基因，將其亞克隆到P-Flag真核表達(dá)載體，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot鑒定。 結(jié)果特異擴(kuò)增CLN8基因編碼序列，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P-Flag-CLN8，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，Westernb